王聰 黃幼生 蔡仁桑

1?？谑械谌嗣襻t(yī)院呼吸內(nèi)科（?？?570000）；2海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科（?？?570102）

肺癌作為全世界最常見、發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其死亡率更是達到49.60/10萬人，位于惡性腫瘤首位［1］。而非小細胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer，NSCLC）作為肺癌最常見的組織學類型，約占肺癌總數(shù)的80%以上，相對于其他種類的肺癌，其增殖、遷移等相對較快，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，其5年生存率較低［2］。MicroRNA（miRNA）是長約 22 nt的非編碼RNA，能與目標靶基因特異性結(jié)合，介導生物信號的調(diào)節(jié)。當前研究已表明，miRNA不僅參與調(diào)控了細胞分化、增殖、遷移以及存活等過程，而且還與糖尿病、心衰以及癌癥在內(nèi)的諸多病理過程有關(guān)［3-4］。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，miR-760在胃癌、乳腺癌、直腸癌等多種癌癥中呈低水平表達［5-9］，提示miR-760可能在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但miR-760是否能作為抑癌基因在NSCLC增殖、遷移等過程發(fā)揮作用尚不清楚，仍需要進一步的研究。因此，本課題旨在闡明miR-760在NSCLC增殖、遷移和侵襲中的作用及其具體機制，為NSCLC的治療及研究提供新的理論依據(jù)及思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑及細胞株人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞源自美國模式菌種收集中心（ATCC），miR-760 mimics、miRNA inhibitors、miRNA mimics control和miRNA inhibitors control均由廣州銳博科技有限公司構(gòu)建?？贵wintegrin β3、cyclin D1、GAPDH均來自cell signaling公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體來自北京康普森生物技術(shù)有限公司，miRNA提取試劑盒來自天根生化科技（北京）有限公司，Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR?Kit試劑盒來自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，MTT檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，Cy-QUANT檢測試劑盒購自sigma公司；RPMI 1640、雙抗來自美國Gibco公司，F(xiàn)BS來自中國四季青公司，其他分析純試劑均為國產(chǎn)。

1.2肺癌A549細胞培養(yǎng)及miR-760轉(zhuǎn)染復蘇A549 細胞，置于10%FBS+RPMI1640、5%CO2、37℃貼壁培養(yǎng)，隔天換液，當細胞長至培養(yǎng)皿80%時，消化傳代。選取對數(shù)生長期的細胞，然后進行分組。轉(zhuǎn)染細胞（對照組）：加入相應體積PBS；A549-mimics control組（miRNA過表達對照組）：加入miRNA mimics control，轉(zhuǎn)染濃度50 nmoL；A549-inhibitor control組（miRNA抑制對照組）：加入miRNA inhibitors control，轉(zhuǎn)染濃度 100 nmol；A549-760（+）組（miR-760過表達組）：加入miR-760 mimics，轉(zhuǎn)染濃度50 nmoL；A549-760（-）組（miR-760抑制組）：加入miRNA inhibitors，轉(zhuǎn)染濃度100 nmoL，加入相應轉(zhuǎn)染試劑后，按照轉(zhuǎn)染試劑盒使用說明進行轉(zhuǎn)染24 h，PBS洗滌，換新培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3MTT細胞活力與CyQUANT細胞增殖檢測MTT細胞活力檢測：取對數(shù)生長期的細胞按照5×103cell/孔種植于96孔板中，每組設置復孔8個，共鋪設5板。置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)12 h，加入相應miRNA，轉(zhuǎn)染24 h，然后換液（此時即為0 h）。繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，然后吸棄培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液100 μL和5 mg/mL的MTT溶液 20 μL，孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩孵育10 min。酶聯(lián)免疫檢測儀492 nm測定光吸收值。CyQUANT細胞增殖檢測：與MTT細胞活力檢測前面步驟相同，細胞分組培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，吸棄培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板于70℃冷凍1 h以上。然后于室溫化凍，然后加入200 μL的CYQUANTGR染液/細胞裂解液，渦旋混勻，避光室溫孵育5 min，酶標儀檢測熒光值（激發(fā)光485 nm，發(fā)射光535 nm）。

1.4細胞劃痕實驗6孔板背面用marker筆每隔1 cm劃水平線，每孔劃線至少3條。將control，A549-760（+），A549-760（-），A549-mimics control，A549-inhibitor control各組細胞以5×104cell/孔密度種植，當細胞長至70%時，吸棄培養(yǎng)液。使用200 μL槍頭垂直于背面水平線在6孔板內(nèi)表面劃痕，每孔劃5條，PBS漂洗，加入2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，并于劃痕與橫線交叉處拍照記錄。然后繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，以同樣放大倍數(shù)拍照，比較各組細胞遷移率。

1.5Matrigel transwell小室細胞侵襲實驗預冷移液槍頭吸取40 μL的 Matrigel，均勻加入Transwell小室內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h。然后將各組細胞以2×105cell/孔種植于小室內(nèi)，然后加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)液150 μL。在孔板內(nèi)加入含 20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液 600 μL，之后將Transwell小室放入板內(nèi)培養(yǎng)。48 h之后取出小室，輕輕擦去Matrigel膠及膠上未遷出細胞，PBS洗滌，結(jié)晶紫染色，隨機選取4個視野計數(shù)細胞。

1.6miRNA quantitative real-time PCR測定通過miRNA提取試劑盒提取組織及細胞miRNA，按照Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR?Kit試劑盒的使用說明書進行逆轉(zhuǎn)錄及定量分析。結(jié)果通過2-△△CT相對定量法進行分析（miR-760 forward，5′-TAT TGCTTAAGAATACGCGTAG-3′and reverse 5′-AAC TCCAGCAGGACCATGTGAT-3′）。

1.7Western blot法檢測integrin β3、cyclin D1蛋白表達提取蛋白樣品后，BCA法測定蛋白濃度，按照30 μg/每通道上樣量，130 V進行SDS-PEGE電泳，然后恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后將其放置于脫脂奶粉（50 g/L）溶液中封閉2 h。然后一抗（1∶1 000 integrin β3和cyclin D1）4℃孵育過夜。TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌，ECL發(fā)光。

1.8統(tǒng)計學方法本論文所有數(shù)據(jù)以±s表示，每組數(shù)據(jù)均進行3次以上重復，使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行匯總分析，數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1qRT-PCR法檢測miR-760表達差異qRTPCR檢測miR-760基因在NSCLC細胞系（A549，SPC-A1，H1299，H23）及癌旁組織中的表達差異，結(jié)果顯示：miR-760 mRNA在NSCLC細胞系中的表達明顯低于癌旁組織（圖1）。

2.2miRNA轉(zhuǎn)染A549細胞鑒定與Control組和A549-mimics control相比，A549-760（+）組（過表達組）細胞miR-760的表達較對照組明顯增加；與control組和A549-inhibitor control相比，而A549-760（-）組（抑制組）miR-760表達較對照組明顯降低（P ＜0.05）；其次與 control組細胞相比，A549-mimics control和A549-inhibitor control組細胞miR-760 mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2）。

圖1 qRT-PCR檢測miR-760基因在NSCLC細胞系及癌旁組織中的表達Fig.1 Expression of miR-760 in the NSCLC cell lines and the adjacent normal tissues was detected by qRT-PCR

圖2 qRT-PCR檢測miR-760表達Fig.2 Expression of miR-760 was measured by qRT-PCR

2.3 miR-760對細胞活力及增殖能力的影響MTT和CyQUANT試劑盒檢測各組細胞在96 h內(nèi)的細胞活力與增殖能力。結(jié)果顯示：A549-miR-760（-）組在培養(yǎng)48 h后，其細胞活力及增值率較對照組明顯增高（P＜0.05），而A549-760（+）組在培養(yǎng)72 h后呈現(xiàn)統(tǒng)計學差異，其細胞活力降低（P＜0.05），增殖減慢（P＜0.05）（圖3）。

圖3 MTT和CyQUANT檢測細胞活力及增殖Fig.3 MTT and CyQUANT assay for assessing cell metabolic activity and proliferation

2.4 miR-760對A549細胞侵襲能力的影響Matrigel-Transwell實驗檢測miR-760對A549細胞體外侵襲能力的影響，結(jié)果表明：A549-760（+）組穿過濾膜的細胞數(shù)量與Control組和A549-mimics Control相比，顯著減少（P ＜ 0.05），而 A549-760（-）組與control組和A549-inhibitor control相比穿過濾膜的細胞數(shù)量則明顯增加（P＜0.05）；A549-mimics Control和A549-inhibitor control組穿過濾膜的細胞數(shù)量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（圖4）。

2.5 miR-760對肺癌A549細胞遷移能力的影響細胞劃痕實驗以檢測miR-760對A549遷移能力的影響，結(jié)果顯示：同Control組相比，A549-760（+）組細胞遷移能力明顯減弱，而A549-760（-）組遷移能力卻顯著增強A549-mimics Control和A549-inhibitor control組細胞遷移能力與對照組相比無明顯變化（圖5）。

2.6 miR-760對integrin β3和cyclin D1的影響檢測integrin β3和cyclin D1基因在NSCLC細胞系（A549，SPC-A1，H1299，H23）及癌旁組織中的表達差異，結(jié)果顯示：integrin β3和cyclin D1在NSCLC細胞系中的表達明顯高于癌旁組織，結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.005）。而且，A549-760（+）細胞integrin β3和cyclin D1蛋白的表達最低，A549-760（-）細胞integrin β3和cyclin D1蛋白的表達量最高，差異有統(tǒng)計學意義（圖6，P＜0.005）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，當肺癌患者其癌細胞未發(fā)生轉(zhuǎn)移時，5年生存率可達50%，但是如若患者癌細胞已經(jīng)局部浸潤或者發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其5年生存率會直接下降達到20%，而發(fā)生癌癥遠處轉(zhuǎn)移的患者其5年生存率更是低至4%［10-11］，由此可見細胞的快速侵襲、增殖和遷移效率是影響肺癌患者預后效果，甚至進一步導致其死亡的主要因素［12］。而NSCLC作為肺癌的主要類型，因增殖轉(zhuǎn)移較快，多數(shù)患者在就診時其癌細胞就已浸潤周圍的正常組織。因此，找尋并探索抑制NSCLC侵襲、增殖和遷移的方法與機制，是目前NSCLC的臨床治療急需解決的問題。

圖5 過表達miR-760抑制細胞遷移Fig.5 miR-760 overexpression suppressed the cell migration

圖6 過表達miR-760抑制integrin β3和cyclin D1的表達Fig.6 Overexpression of miR-760 inhibited the integrin β3 and cyclin D1 expression

miRNA被發(fā)現(xiàn)可以與靶基因mRNA進行不同程度的特異性結(jié)合，促使靶基因的抑制與降解，參與調(diào)控了多種生物學過程，如組織分化、衰老死亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展等［13］。而且目前已有研究發(fā)現(xiàn)：miRNA在多種癌癥中存在差異，并具有抑癌基因作用。miR-760相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中過表達miR-760可以抑制乳腺癌的增殖和遷移［7］。除此之外，KIM等［9］研究表明結(jié)腸直腸癌患者血液miR-760含量明顯低于健康患者。但miR-760在肺癌，特別是在NSCLC中增殖、遷移和侵襲中的作用尚不清楚?；诖?，筆者探索了miR-760在NSCLC增殖、遷移和侵襲中的作用及其調(diào)控機制，為其的臨床治療提供新思路。

本研究對NSCLC細胞系及癌旁組織中的miR-760基因表達進行差異檢測，發(fā)現(xiàn)miR-760的表達在NSCLC細胞系中顯著低于癌旁組織，提示miR-760可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的負性調(diào)節(jié)作用。筆者在體外建立過表達和低表達miR-760的A549細胞，進而明確miR-760基因?qū)Ψ伟┘毎鲋尺w移等生物學能力的影響。采用MTT、CyQUANT、細胞遷移和侵襲檢測首先明確了miR-760在A549細胞增殖、遷移及侵襲作用。結(jié)果顯示，miR-760負性調(diào)節(jié)了A549細胞的增殖、遷移及侵襲，過表達miR-760將抑制A549細胞其增殖、遷移及侵襲能力，抑制miR-760表達則增強A549細胞增殖、遷移及侵襲能力。Integrin β3作為一類介導細胞外基質(zhì)與細胞內(nèi)微環(huán)境物理連接和信息連接的跨膜受體，控制著細胞的粘附、運動、遷移、增殖和凋亡等基本細胞生物學功能，與腫瘤等重大疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：過表達miR-760，能夠A549細胞抑制Integrin β3表達及周期蛋白Cyclin D1表達；而抑制miR-760表達則上調(diào)Integrin β3及周期蛋白Cyclin D1。

總之，本研究證明miR-760可能是通過抑制integrin β3表達，對NSCLC的增殖、遷移及侵襲具有負性調(diào)節(jié)作用，這將為肺癌患者的臨床治療提供了新的靶點與思路。