張 珂，姜 橫，孟怡辰，周許輝

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院骨科，上海 200003

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸（AIS）是最常見的脊柱畸形，其病因未明［1］。椎旁肌的不平衡在AIS的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用［2］。有文獻(xiàn)報道，AIS患者兩側(cè)椎旁肌的肌電活動和肌纖維類型存在差異，且與患者的側(cè)凸角度進(jìn)展相關(guān)［3］。本研究組前期通過影像學(xué)測量發(fā)現(xiàn)，AIS患者兩側(cè)椎旁肌的肌容積和脂肪浸潤率不對稱［4］。另有研究顯示，AIS患者兩側(cè)椎旁肌褪黑素受體和轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路相關(guān)分子表達(dá)不對稱，但對于上述椎旁肌的復(fù)雜改變的分子機制仍鮮有報道［5-6］。

微RNA（miRNA）通過調(diào)控基因表達(dá)在多種生物過程中發(fā)揮重要作用［7］。研究顯示，一些肌肉特異性miRNAs能調(diào)節(jié)肌肉的各項功能，包括成肌細(xì)胞增殖、分化、收縮性能和壓力反應(yīng)等［8-9］。另外，肌肉特異性miRNA也與心臟肥大、心力衰竭、心律失常、先天性心臟病和肌營養(yǎng)不良等肌肉相關(guān)性疾病密切相關(guān)［10-11］。因此，本研究欲探尋調(diào)節(jié)患者椎旁肌改變的關(guān)鍵miRNA及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月—2016年9月本院收治的漢族女性AIS患者30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①AIS診斷明確；②側(cè)凸Cobb角＞ 40°；③臨床資料和影像學(xué)資料完整；④不伴椎間盤突出、峽部裂等其他脊柱疾病，既往無針對肌肉功能治療史或其他脊柱手術(shù)史。所有患者均被告知研究內(nèi)容并簽署知情同意書。凹側(cè)與凸側(cè)椎旁肌組織為盡量遠(yuǎn)離電刀處理過的多裂肌組織500 ～ 1 000 mg（約黃豆大?。?，去除壞死組織和殘留血漬后置入凍存管，并迅速置于液氮罐內(nèi)保存。

1.2 影像學(xué)測量和臨床數(shù)據(jù)

所有患者術(shù)前拍攝標(biāo)準(zhǔn)站立位脊柱全長正側(cè)位X線片，測量側(cè)凸Cobb角并記錄頂椎位置。使用電子病歷收集患者臨床信息，包括手術(shù)年齡、月經(jīng)初潮時間、是否進(jìn)行過支具或牽引等治療。

1.3 miRNA高通量測序

取其中3例在發(fā)病年齡、手術(shù)年齡、Lenke分型、角度大小、Risser征等參數(shù)相匹配的患者凹側(cè)和凸側(cè)椎旁肌組織，提取總RNA，測定RNA純度與質(zhì)量，在5’和3’端分別連接接頭序列，形成帶有接頭的單鏈RNA，反轉(zhuǎn)錄生成RNA/DNA雜交鏈，PCR擴增構(gòu)建small RNA-seq cDNA文庫，采用illumina Hiseq測序平臺（上海晶能生物有限公司，中國）單端測序模式進(jìn)行高通量測序。

1.4 實時熒光定量PCR

取其余27例患者的椎旁肌組織，驗證高通量測序的質(zhì)量及差異miRNAs的表達(dá)情況。使用TRIzol（Invitrogen公司，美國）提取椎旁肌組織總RNA，用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo公司，美國）測定RNA濃度與純度。采用SYBR GreenⅡ20 μL體系擴增miRNA。具體反應(yīng)體系、反應(yīng)程序根據(jù)試劑盒說明書設(shè)定（TaKaRa公司，日本），以U6 snRNA作為內(nèi)參。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃起始激活3 min；95℃變性12 s、62℃退火40 s、72℃延伸45 s，40個循環(huán)；最終72℃延伸5 min。采用ΔCt法計算miRNA的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩側(cè)椎旁肌組織相關(guān)miRNA表達(dá)水平的比較采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗。采用Pearson相關(guān)性分析對兩側(cè)miRNAs相對表達(dá)量的差值與患者臨床信息（手術(shù)年齡、術(shù)前側(cè)凸Cobb角）的關(guān)系進(jìn)行分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

由miRNAs聚類熱圖（圖1）可知，AIS患者凹側(cè)和凸側(cè)椎旁肌存在差異表達(dá)miRNA。共有18個miRNA表達(dá)有差異，其中凹側(cè)較凸側(cè)表達(dá)量增加的12個，增加倍數(shù)最大的是miR-424；凸側(cè)較凹側(cè)表達(dá)量增加的6個，增加倍數(shù)最大的是miR-517（表1）。

圖1 AIS患者兩側(cè)椎旁肌組織差異miRNA聚類熱圖（n=3）Fig. 1 MiRNAs clustering thermal map of bilateral paraspinal muscles in AIS patients（n=3）

表1 AIS患者兩側(cè)椎旁肌miRNA表達(dá)差異Tab. 1 Differences in miRNAs expression between bilateral paraspinal muscles in AIS patients n=3

為驗證高通量測序的質(zhì)量和測序篩選獲得差異miRNAs的表達(dá)情況，在27例AIS患者兩側(cè)椎旁肌組織中對測序結(jié)果中變化倍數(shù)最大的6個miRNA進(jìn)行表達(dá)驗證，分別為凹側(cè)含量較高的miR-424、miR-433、miR-769和凸側(cè)含量較高miR-516、miR-517、miR-495。目標(biāo)miRNA的相對表達(dá)量（ΔCt）=Ct目標(biāo)miRNA表達(dá)量-CtU6。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示僅miR-516、miR-517和miR-495的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，圖2）。

相關(guān)性分析顯示，兩側(cè)椎旁肌miR-516相對表達(dá)量差值與患者發(fā)病年齡呈負(fù)相關(guān)（r=-0.452），miR-517相對表達(dá)量差值與側(cè)凸Cobb角呈負(fù)相關(guān)（r=-0.378）。

圖2 AIS患者兩側(cè)椎旁肌差異表達(dá)miRNA驗證（n=27）Fig. 2 Veri fi cation of differential expression of miRNAs in bilateral paraspinal muscles of AIS patients（n=27）

3 討 論

AIS患者側(cè)凸角度有進(jìn)展風(fēng)險，目前臨床上主要處理措施是佩戴支具預(yù)防角度進(jìn)展，針對大角度的側(cè)凸進(jìn)行手術(shù)矯形?；颊唠S訪檢查接受的輻射、高昂的手術(shù)費用和繼發(fā)的心肺功能障礙造成了巨大的社會負(fù)擔(dān)［12］。對AIS發(fā)生機制的深入研究有助于更好地為疾病的診斷、治療甚至預(yù)防提供新思路。由于遺傳異質(zhì)性和缺乏合適可靠的動物模型，目前AIS的病因和病理機制尚未明確［13］。有學(xué)者認(rèn)為，在AIS的發(fā)生和進(jìn)展中，椎旁肌組織的代償性功能能維持脊柱的穩(wěn)定性，當(dāng)肌肉力量不足時，椎體內(nèi)在的旋轉(zhuǎn)不穩(wěn)定導(dǎo)致側(cè)凸角度增大［2，14-15］。上述研究主要從功能學(xué)和形態(tài)學(xué)方面闡述AIS患者兩側(cè)椎旁肌的不對稱，卻未對產(chǎn)生這種改變的分子機制進(jìn)行闡述。本研究通過RNA高通量測序發(fā)現(xiàn)AIS患者兩側(cè)椎旁肌miR-516、miR-517、miR-495存在差異表達(dá)，且miR-516的相對表達(dá)差值與患者手術(shù)年齡呈負(fù)相關(guān)，miR-517的相對表達(dá)差值與患者側(cè)凸Cobb角呈負(fù)相關(guān)。

有研究報道，在凹側(cè)椎旁肌表達(dá)升高的miR-495與骨骼肌的再生關(guān)系密切［16］。miR-495位于Gtl2-Dio3基因座［17］，Gtl2-Dio3編碼的miRNA能抑制分泌型卷曲相關(guān)蛋白（sFRP）的分泌，后者是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑。動物實驗表明Gtl2-Dio3編碼的miRNA（包括miR-495）在再生MEF2A敲除肌組織中表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致sFRP的表達(dá)上調(diào)和Wnt信號通路的活性減弱［18］。因此，miR-495在MEF2A的調(diào)控下對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)在骨骼肌的再生過程中發(fā)揮重要作用。

miR-516和miR-517共同位于C19MC基因簇內(nèi)［19-20］。有研究表明，該基因簇內(nèi)的miRNA在成體組織中的表達(dá)量均較小［21］，而在早期胚胎發(fā)育過程中顯著高表達(dá)［22］。該基因簇內(nèi)的miRNA的調(diào)控功能大多與腫瘤的發(fā)生相關(guān)［23］。目前miR-516和miR-517在骨骼肌發(fā)育或AIS的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用尚未見報道。

本研究組前期發(fā)現(xiàn)AIS患者兩側(cè)椎旁肌的肌容積和脂肪浸潤率不對稱［4］，本研究結(jié)果提示兩側(cè)椎旁肌中與骨骼肌再生相關(guān)的miRNA表達(dá)存在差異，推測在應(yīng)力或青春期各種內(nèi)外因素的作用下，兩側(cè)椎旁肌的miRNA表達(dá)發(fā)生改變，異常表達(dá)的miRNA通過調(diào)控特異性靶基因的表達(dá)而引起肌細(xì)胞生長發(fā)育和其他功能的變化，導(dǎo)致兩側(cè)椎旁肌收縮性能出現(xiàn)差異，最終引起側(cè)凸的出現(xiàn)或加重。miRNA在AIS患者兩側(cè)椎旁肌中差異表達(dá)的機制仍需進(jìn)一步研究，以解釋其介導(dǎo)椎旁肌不平衡改變的作用機制。