任彩婷 ，王 魯 ，龐亞琴 ，徐秋曼

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

銅是維持植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素之一，參與植物體內(nèi)的多個(gè)生理過(guò)程.近年來(lái)，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展和含銅礦產(chǎn)的開采，土壤中含銅量達(dá)到原始土壤的幾倍甚至幾十倍，嚴(yán)重威脅到生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和安全[1-2].土壤中過(guò)量的銅一方面會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害，影響植物的代謝機(jī)制，甚至抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育[3-5]；另一方面，銅會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，最終危害人體健康[6-7].因此銅污染問(wèn)題引起了許多學(xué)者的關(guān)注，銅對(duì)各種作物的影響也多見報(bào)道[8-10].

采用物理或化學(xué)方法治理土壤重金屬污染所需成本較高，而且容易產(chǎn)生二次污染，治理效果不理想，因此近年來(lái)人們把研究方向轉(zhuǎn)移到生物修復(fù)和防治.芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、在植物表面易于存活與繁殖、制劑穩(wěn)定、施用方便等優(yōu)點(diǎn)[11].芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是土壤中廣泛分布的一種需氧型細(xì)菌，除對(duì)人畜無(wú)害和不污染環(huán)境之外，還對(duì)生活在重金屬污染土壤上的植物有生長(zhǎng)促進(jìn)作用，因此在防治植物病蟲害和修復(fù)土壤重金屬污染方面受到了廣泛關(guān)注[12-15].如肖亞靜等[16]研究表明，枯草芽孢桿菌21可以提高玉米各組織中的POD活性和地下組織中的CAT活性；范仲學(xué)等[17]發(fā)現(xiàn)，每千克土壤中施用2 g枯草芽孢桿菌可以提高花生的主莖高、側(cè)枝長(zhǎng)、植株鮮重、單株果重和飽果率，使籽粒中鎘的積累量降低25.37%.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）也是芽孢桿菌屬中的一種好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，與枯草芽孢桿菌具有很高的親緣性，目前關(guān)于解淀粉芽孢桿菌的生防多集中在植物病害防治、果蔬保鮮、增加抗鹽性等方面[18-19]，在防治重金屬污染方面還鮮見報(bào)道.

洋蔥（Allium cepa L.），又名蔥頭，屬百合科蔥屬二年生草本植物[20]，是世界上主要的蔬菜品種，也是中國(guó)主要栽培和出口蔬菜品種，具有抗菌、預(yù)防心血管疾病、降血糖、抗氧化的保健功能[21-22].洋蔥容易培養(yǎng)、根系發(fā)達(dá)、染色體數(shù)目較少，但對(duì)環(huán)境變化敏感，是環(huán)境監(jiān)測(cè)的優(yōu)選植物[23].納明亮[24]曾研究了銅、鋅、鉛對(duì)洋蔥、番茄、黃瓜等蔬菜的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)褐土和黃泥土基質(zhì)中，洋蔥對(duì)銅的毒性響應(yīng)最敏感.本課題組以洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料，研究枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌對(duì)重金屬銅脅迫下洋蔥根系生長(zhǎng)、生理活性以及根尖細(xì)胞有絲分裂的影響，以期為植物的銅脅迫損傷修復(fù)和芽孢桿菌屬細(xì)菌發(fā)酵液在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

洋蔥，購(gòu)自市場(chǎng)，栽種地附近沒(méi)有污染源.

解淀粉芽孢桿菌HM618和枯草芽孢桿菌77發(fā)酵液均由天津大學(xué)程景勝課題組提供.解淀粉芽孢桿菌HM618純培養(yǎng)發(fā)酵液，記為HM；枯草芽孢桿菌77純培養(yǎng)發(fā)酵液，記為BS；解淀粉芽孢桿菌HM618和枯草芽孢桿菌77混合培養(yǎng)發(fā)酵液，記為HM+BS.

1.2 方法

1.2.1 洋蔥的培養(yǎng)與處理

選取完好無(wú)損、大小均勻的洋蔥，剝掉外層的干燥鱗莖，去掉老根，置于盛有自來(lái)水的燒杯上，在室溫條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，每24 h換一次水.待根尖長(zhǎng)至2～3 cm，從中選取生長(zhǎng)一致的40頭洋蔥，平均分成8組，分別為對(duì)照組（CK）、CK+HM、CK+BS、CK+HM+BS、Cu、Cu+HM、Cu+BS、Cu+HM+BS.將 CuSO4·5H2O用蒸餾水配成濃度為40μmol/L的溶液，將發(fā)酵液均稀釋10倍.將分組后的洋蔥移至盛有硫酸銅溶液和細(xì)菌發(fā)酵液的50 mL燒杯中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h更換一次處理液.

1.2.2 洋蔥根長(zhǎng)的測(cè)量

在處理7 d后測(cè)量洋蔥的根長(zhǎng)，每個(gè)處理組隨機(jī)選取15條根進(jìn)行測(cè)量.

1.2.3 相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量的測(cè)定

分別在處理 4、5、6、7 d 后，稱取 0.2 g根，在每一個(gè)試管中放入8 mL蒸餾水，放置4 h后，測(cè)定電導(dǎo)率R1.然后將試管放于沸水浴中加熱10 min，迅速冷卻至室溫，測(cè)其電導(dǎo)率R2.按下列公式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率（Relative conductivity，REC），進(jìn)行3次平行處理.根據(jù)張志良等[25]的方法測(cè)定丙二醛（MDA）含量.

1.2.4 根尖細(xì)胞染色體形態(tài)的觀察

分別在銅處理 24、48、72 h 后，于 11 ∶00—13 ∶00取材，每個(gè)處理組中隨機(jī)挑選5個(gè)根尖，水洗后，置于卡諾氏固定液中固定24 h，之后移入70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇中，于4℃冰箱中保存.制片時(shí)，先用蒸餾水沖洗根尖，然后將根尖放入盛有1 mol/L HCl的試管中，在60℃恒溫水浴條件下解離5～6 min.用改良苯酚品紅染色液染色10～15 min，鏡檢，觀察細(xì)胞分裂是否有異常.統(tǒng)計(jì)出細(xì)胞分裂的個(gè)數(shù)，計(jì)算有絲分裂指數(shù)和染色體畸變率，計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Excel程序作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下洋蔥根尖的生長(zhǎng)

用不同的處理液處理洋蔥7 d后，各處理組中的根長(zhǎng)如圖1所示.由圖1可以看出，當(dāng)銅脅迫不存在時(shí)，培養(yǎng)液中添加解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液或枯草芽孢桿菌發(fā)酵液均不會(huì)影響洋蔥根的生長(zhǎng)，但同時(shí)添加2種發(fā)酵液則對(duì)洋蔥生長(zhǎng)有顯著抑制作用（P<0.05）.當(dāng)洋蔥用含有40 μmol/L CuSO4·5H2O的培養(yǎng)液處理7 d后，根長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組的根長(zhǎng)，可見洋蔥遭受了非常嚴(yán)重的銅脅迫.添加了解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液或枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的處理組中，洋蔥根長(zhǎng)顯著增加，比未添加發(fā)酵液處理組的根長(zhǎng)分別提高了70.59%和177.94%，但仍然顯著低于未添加CuSO4·5H2O的處理組.同時(shí)添加2種發(fā)酵液的處理則對(duì)洋蔥遭受的銅脅迫不產(chǎn)生緩解作用.總的來(lái)看，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均對(duì)銅脅迫下洋蔥根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且后者的作用效果更顯著，但不能完全解除銅的抑制作用；同時(shí)添加2種發(fā)酵液對(duì)洋蔥遭受的銅脅迫沒(méi)有任何緩解作用.

圖1 不同處理組中洋蔥的根長(zhǎng)Fig.1 Root length of Allium cepa L.in different treatment groups

2.2 不同處理下洋蔥根系的相對(duì)電導(dǎo)率

相對(duì)電導(dǎo)率是反映植物膜系統(tǒng)狀況的一個(gè)重要生理生化指標(biāo)，植物在受到逆境或者其他損傷的情況下細(xì)胞膜容易破裂，造成胞質(zhì)的胞液外滲，從而相對(duì)電導(dǎo)率增大[26].不同發(fā)酵液對(duì)銅脅迫下洋蔥根的相對(duì)電導(dǎo)率的影響如圖2所示.

圖2 不同處理組中洋蔥根系的相對(duì)電導(dǎo)率Fig.2 Relative conductivity of Allium cepa L.root in different treatment groups

由圖2可以看出，未施加銅脅迫之前，洋蔥根系的相對(duì)電導(dǎo)率處于較低水平，培養(yǎng)液中添加解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液或枯草芽孢桿菌發(fā)酵液能夠進(jìn)一步降低根系的相對(duì)電導(dǎo)率，二者的作用效果同對(duì)照組相比差異不大.同時(shí)添加2種發(fā)酵液時(shí)，洋蔥根系的相對(duì)電導(dǎo)率小幅度增加.施加銅脅迫后，洋蔥根系的相對(duì)電導(dǎo)率大幅度增加，培養(yǎng)液中單獨(dú)添加解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液或枯草芽孢桿菌發(fā)酵液能夠顯著降低根系的相對(duì)電導(dǎo)率，尤其是枯草芽孢桿菌作用效果顯著.同時(shí)添加2種發(fā)酵液則會(huì)使洋蔥根系的相對(duì)電導(dǎo)率略增加.未施加銅脅迫的4個(gè)處理組中，洋蔥根系的相對(duì)電導(dǎo)率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在處理5 d后達(dá)到最大值；而施加銅脅迫的4個(gè)處理組中，相對(duì)電導(dǎo)率則隨時(shí)間呈先降低后增加的趨勢(shì)，在處理5 d后達(dá)到最小值.

2.3 不同處理下洋蔥根系的丙二醛含量

MDA是生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，其濃度高低可用來(lái)表示脂質(zhì)過(guò)氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)的受傷害程度，是一種重要的逆境生理指標(biāo)[27].圖3顯示了洋蔥經(jīng)過(guò)銅及發(fā)酵液處理后根系中MDA含量的變化.

圖3 不同處理組中洋蔥根系的丙二醛含量Fig.3 MDA content of Allium cepa L.root in different treatment groups

由圖3可以看出，未施加銅脅迫的4個(gè)處理組中，洋蔥根系的MDA含量處于較低水平，CK、CK+HM、CK+BS組的MDA含量相近，CK+HM+BS組在培養(yǎng)后期的MDA含量略有增加.施加銅脅迫后，洋蔥根中的MDA含量急劇增加.向含有CuSO4·5H2O的培養(yǎng)液中添加解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液或枯草芽孢桿菌發(fā)酵液后，在培養(yǎng)初期和中期，洋蔥根中的MDA含量顯著降低，后期解淀粉芽孢桿菌的作用效果則不顯著.2種細(xì)菌相比，枯草芽孢桿菌對(duì)洋蔥根系MDA的抑制效果更好，但同時(shí)添加2種細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)銅脅迫造成的洋蔥根中MDA的生成非但沒(méi)有抑制效果，反而會(huì)使MDA含量小幅增加.

2.4 不同處理下洋蔥根尖細(xì)胞的有絲分裂

8個(gè)處理組中，洋蔥根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)隨時(shí)間的變化如表1所示.

表1 不同處理組中洋蔥根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)Tab.1 Mitosis index of chromosome of Allium cepa L.root tip cells in different treatment groups %

由表1可以看出，未施加銅脅迫的4個(gè)處理組中，CK、CK+HM、CK+BS組中洋蔥根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)在整個(gè)觀測(cè)期內(nèi)都相近（P＞0.05），同時(shí)施加2種細(xì)菌發(fā)酵液時(shí)，細(xì)胞有絲分裂指數(shù)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.對(duì)洋蔥施加銅脅迫后，根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)大幅度下降，未添加細(xì)菌發(fā)酵液的銅處理組中，洋蔥培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞有絲分裂指數(shù)同對(duì)照組相比降低了86.47%.添加解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液或枯草芽孢桿菌發(fā)酵液后，洋蔥根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)增加，尤其是枯草芽孢桿菌對(duì)細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的增加效果更顯著.當(dāng)向銅脅迫處理組中同時(shí)添加2種細(xì)菌發(fā)酵液時(shí)，洋蔥根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)降低.

2.5 不同處理下洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的染色體畸變率

8個(gè)處理組中，洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的染色體畸變情況如表2所示.

表2 不同處理組中洋蔥根尖細(xì)胞染色體的畸變率Tab.2 Aberration rate of chromosome of Allium cepa L.root tip cells in different treatment groups %

由表2可以看出，在觀測(cè)期內(nèi)，對(duì)照組中洋蔥根尖細(xì)胞染色體的畸變率始終最低.未施加銅脅迫的CK+HM和CK+BS組中染色體的畸變率與對(duì)照組相近，也比較低；同時(shí)添加了2種細(xì)菌發(fā)酵液的CK+HM+BS組中，染色體的畸變率顯著增加（P<0.05）.施加了銅脅迫后，洋蔥根尖細(xì)胞染色體的畸變率大幅度增加，如培養(yǎng)24 h后的畸變率比對(duì)照組增加了273.24%.培養(yǎng)液中添加了解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液或枯草芽孢桿菌發(fā)酵液后，染色體畸變率顯著降低，尤其是枯草芽孢桿菌的作用效果更顯著.同時(shí)添加2種細(xì)菌時(shí)，畸變率與單純的銅脅迫處理組相近.

2.6 銅脅迫下洋蔥根尖染色體的畸變類型

洋蔥根尖染色體的正常和畸變類型如圖4所示.絕大多數(shù)根尖細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程是正常的，并且可以形成2個(gè)子細(xì)胞，前期（Mitosis prophase）、中期（Mitosis metaphase）、后期（Mitosis telophase）如圖 4（a）～4（c）所示.不同濃度的硫酸銅溶液處理會(huì)誘導(dǎo)洋蔥根尖細(xì)胞出現(xiàn)染色體畸變現(xiàn)象，畸變類型如圖 4（d）～4（g）所示，主要有染色體粘連（Chromosome stickness）、染色體滯后（Chromosome lagging）、染色體斷片（Chromosome fragment）、染色體橋（Chromosome bridge）等.

圖4 根尖細(xì)胞染色體正常有絲分裂與畸變類型Fig.4 Normal mitosis and aberration types of chromosome of root tip cells

3 討論與結(jié)論

銅是具有雙重性的重金屬元素，土壤中的銅在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)植物有益，過(guò)量則會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[28-29].本研究對(duì)洋蔥施加銅脅迫后，測(cè)試枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌對(duì)洋蔥遭受銅脅迫的緩解作用.結(jié)果表明，洋蔥在遭受銅脅迫后，根系生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量顯著增加.培養(yǎng)液中添加了枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌時(shí)，能夠在一定程度上緩解洋蔥根系遭受的銅脅迫，但二者疊加則未產(chǎn)生緩解作用.

植物生長(zhǎng)發(fā)育依賴于細(xì)胞的有絲分裂[30]，根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)作為表示體細(xì)胞繁殖活動(dòng)程度的指數(shù)[31]，代表著根尖分裂細(xì)胞數(shù)占分生區(qū)細(xì)胞總數(shù)的比例，其值越高，意味著處于分裂期的細(xì)胞越多，單位時(shí)間內(nèi)形成的子細(xì)胞越多，植物生長(zhǎng)越旺盛，反之則生長(zhǎng)不良[32].銅對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂造成的影響，可以通過(guò)細(xì)胞有絲分裂指數(shù)和染色體畸變現(xiàn)象反映出來(lái).本研究用40 μmol/L的CuSO4·5H2O溶液處理洋蔥幼苗，根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)顯著降低，畸變率增加.枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌均能夠緩解洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的異常，枯草芽孢桿菌的作用效果更顯著，但2種細(xì)菌的聯(lián)合使用則沒(méi)有緩解效果，具體原因有待于進(jìn)一步研究.銅脅迫作用下，洋蔥根尖染色體細(xì)胞中出現(xiàn)染色體橋、染色體滯后、染色體粘連、染色體斷片等畸變現(xiàn)象，可能途徑為：①銅直接作用于帶負(fù)電的DNA分子，造成斷裂損傷；②銅干擾了蛋白質(zhì)合成或轉(zhuǎn)錄，使得與染色體運(yùn)動(dòng)、DNA合成有關(guān)的物質(zhì)不能形成；③銅通過(guò)干擾某些損傷的正常修復(fù)過(guò)程，阻止染色體在正常條件下的重建[33-34].