曲 莉,李善姬,徐 斌,白雪松

（1.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林 吉林 132013;2.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林 吉林 132013）

鄰苯二甲酸酯類（phthalic acid esters.PAEs）是公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,在PAEs類塑化劑中最常使用的是鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[Di-（2-ethylhexyl）phtha-late,DEHP],其產(chǎn)量占到鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總產(chǎn)量的50%以上[1]。DEHP主要應(yīng)用于各種塑料包裝用品,同時(shí)在涂料、印刷油墨、染料、農(nóng)藥等工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。DEHP以非共價(jià)鍵與聚氯乙烯等物質(zhì)結(jié)合,在塑料產(chǎn)品使用過程中被釋放出來,形成環(huán)境污染物[2]。DEHP一般是通過污染的大氣、水體、土壤和食物等途徑進(jìn)入人體[3],可對肝、腎、心、肺、生殖系統(tǒng)等臟器產(chǎn)生較大的毒性損害。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可以影響到人體的內(nèi)分泌進(jìn)程[4],目前最為引人關(guān)注的是其所致生殖損傷,生殖系統(tǒng)作為DEHP毒性作用的主要靶器官,DEHP的雄性生殖毒性主要表現(xiàn)為生殖結(jié)構(gòu)、睪丸組織以及生殖細(xì)胞的異常。本試驗(yàn)以不同劑量DEHP對雄性小鼠進(jìn)行染毒,觀察其對小鼠生殖功能的影響,為進(jìn)一步研究DEHP生殖毒性提供相應(yīng)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只成年健康雄性小鼠,體重為25±2 g。由吉林醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)于溫度22℃ ±2℃,濕度50% ±5%。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器 鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）（純度≥99.5%）,購自美國 Sigma公司;生理鹽水（吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司）;吐溫80（上海盈公生物技術(shù)有限公司）;1%伊紅（武漢博士德生物工程有限公司）;甲醛（上海盛欣醫(yī)藥化工有限公司）;CX41正置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;DT1001電子稱（江蘇省常熟市意歐儀器儀表公司）;FA1104N分析天平（上海天平儀器廠）;HHS電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;精子計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）;HC-1014離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理 將40只成年健康雄性小鼠按體重隨機(jī)分成4組,分別為空白組（生理鹽水）和低（250 mg/kg·bw）、中（500 mg/kg·bw）、高（1 000 mg/kg·bw）劑量DEHP染毒組,每組10只。

DEHP染毒溶液配制方法:取純度99%的DEHP和吐溫80各15 mL到棕色試劑瓶里,以1∶1的體積比溶解,接著取118 mL的0.9%生理鹽水到棕色試劑瓶中,最后取0.6 mL的0.9%生理鹽水到棕色試劑瓶中,配置成濃度為1.0 mg/mL的溶液供高劑量組染毒使用。中、低劑量組用吐溫稀釋成相應(yīng)濃度使用。

每天稱重,根據(jù)體重按灌胃體積（10 mL/kg）給予不同劑量DEHP和生理鹽水,每天一次,連續(xù)4周,試驗(yàn)期間觀察動(dòng)物的活動(dòng)、毛發(fā)及進(jìn)食情況。

1.3.2 睪丸、附睪重量及其臟器系數(shù)測定 處死小鼠前1 d禁食不禁水,稱量小鼠體重,脫臼處死小鼠,迅速取出雙側(cè)睪丸、附睪,并小心剝離周圍的結(jié)締組織和脂肪組織后稱重,計(jì)算其臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%）。

1.3.3 精子計(jì)數(shù)方法 將雙側(cè)附睪放在盛有2 mL生理鹽水的表面皿中,用眼科剪將附睪縱向剪2～3下,再用膠頭吸管將懸浮液輕輕吹打6～7次,靜置5 min,用4層擦鏡紙小心過濾,過濾掉組織碎片,制成精子懸液。吸取一滴精子懸液到精子計(jì)數(shù)板的兩個(gè)計(jì)數(shù)池內(nèi),靜置5 min,先將充好精子懸液的計(jì)數(shù)板小心放置在低倍鏡下,然后轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋找到計(jì)數(shù)板中心方格,選擇精子分布比較均勻的計(jì)數(shù)池,然后轉(zhuǎn)換成高倍鏡觀察,在高倍鏡下數(shù)中間大方格內(nèi)的5個(gè)中方格（4角4個(gè)和中間1個(gè)或?qū)蔷€5個(gè)）,計(jì)數(shù)時(shí)要按一定的順序進(jìn)行,以避免遺漏和重復(fù),壓在雙線上的精子就只計(jì)兩邊,即只計(jì)上方和左側(cè)線上的精子,而壓在下方和右側(cè)線的精子均不計(jì)入（即計(jì)左不計(jì)右,計(jì)上不計(jì)下）。將5個(gè)中方格計(jì)數(shù)的精子數(shù)相加,記為n,以1 mL精子懸液中的精子數(shù)目作為精子總數(shù)（1 mL精子總數(shù)=n×50 000）。

1.3.4 精子畸形率測定 取精子懸液以3 000 r/min離心20 min,吸去離上清液,剩余的少量液體與沉淀搖勻后,取1滴懸液于載玻片一側(cè),均勻涂片,晾干后甲醛固定5 min,晾干后用1%伊紅染液染色1 h,在高倍鏡下檢查精子形態(tài),每只小鼠檢查結(jié)構(gòu)完整的1 000個(gè)精子,并計(jì)算畸形率（%）。

1.4 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)的均采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SE）表示,各實(shí)驗(yàn)組差異檢驗(yàn)采用單因素方差分析,方差齊時(shí),各組間兩兩比較用LSD方法,不齊時(shí),各組間兩兩比較采用Tamhane′s方法。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在染毒期間,各劑量DEHP染毒組與陰性對照組比較,小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、被毛蓬松等中毒癥狀,進(jìn)食情況良好。

2.2 DEHP染毒對雄性小鼠睪丸、附睪重量及其臟器系數(shù)的影響 本次試驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白組比較,中、高劑量DEHP染毒組的小鼠的睪丸、附睪重量及其臟器系數(shù)均下降,低劑量DEHP染毒組僅睪丸重量明顯下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;隨著DEHP染毒劑量的升高,小鼠的睪丸、附睪重量及其臟器系數(shù)呈下降趨勢。結(jié)果見表1。

表1 DEHP染毒對小鼠睪丸、附睪重量及其臟器系數(shù)的影響

2.3 DEHP染毒對小鼠精子計(jì)數(shù)和精子畸形率的影響 本次試驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組比較,各劑量組的小鼠精子計(jì)數(shù)明顯降低、精子畸形率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著DEHP染毒劑量的升高,小鼠精子計(jì)數(shù)呈下降趨勢,精子畸形率呈上升趨勢。結(jié)果見表2。

表2 DEHP染毒對小鼠精子計(jì)數(shù)和畸形率的影響

3 討論

近年來DEHP對雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用越來越受人們關(guān)注,雄性生殖系統(tǒng)是一個(gè)非常復(fù)雜的系統(tǒng),包括睪丸、附睪、精囊、射精管、陰囊、輸精管等。雄性生殖系統(tǒng)中最重要的器官是睪丸,它主要發(fā)揮著生成精子、分泌和合成雄性激素的功能,在維持生育及性功能等方面具有非常重要的作用。臟器系數(shù)即臟器重量/動(dòng)物體重,若受試物使某個(gè)臟器受到損害,如充血、增生、萎縮、水腫等,則該比值就會(huì)發(fā)生變化,可以減小或增大。所以臟器系數(shù)是一個(gè)靈敏和客觀的指標(biāo)[5],它的變化可以比較全面的反映出毒性物質(zhì)對該臟器的影響,與此同時(shí)還能為毒物作用于哪個(gè)靶器官提供重要依據(jù)。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示,雄性小鼠經(jīng)DEHP染毒后,睪丸和附睪臟器系數(shù)有著不同程度的改變,隨著DEHP染毒劑量的升高,與空白組相比,睪丸和附睪臟器系數(shù)降低,表明DEHP對睪丸和附睪有毒性作用。本次試驗(yàn)結(jié)果與丁承輝[6]報(bào)道的結(jié)果一致。

精子數(shù)量是維持雄性生育能力的主要條件,精子計(jì)數(shù)的改變在評價(jià)有害因素對精子生成的影響時(shí)比其他指標(biāo)更為敏感,它是研究環(huán)境因素對雄性生殖健康影響的很重要的觀察終點(diǎn),可反映其生精細(xì)胞的功能,是一種用于評價(jià)精子發(fā)生致毒效應(yīng)的方法[7]。本研究發(fā)現(xiàn)各染毒組雄性小鼠精子計(jì)數(shù)均低于空白組,中、高劑量組小鼠精子計(jì)數(shù)與空白組比較顯著降低,說明DEHP對小鼠的精子生成有抑制作用,對各級精母細(xì)胞有明顯的毒性作用,干擾精子的生長發(fā)育過程。可能的原因是DEHP或其代謝產(chǎn)物直接作用于睪丸組織,一方面DEHP可能損害睪丸間質(zhì)細(xì)胞,引起T分泌的減少,由于睪丸T水平的降低,必定會(huì)對支持細(xì)胞（Sertoli細(xì)胞）產(chǎn)生影響,包括影響它的分泌功能以及對生精細(xì)胞的營養(yǎng)和支持作用,另一方面破壞生精過程,使各級生精細(xì)胞數(shù)量減少,然后精子生成數(shù)量就減少,接著精曲小管管壁也變薄,甚至是精曲小管整體的橫徑變短,生精細(xì)胞變性、脫落進(jìn)入管腔,最終可導(dǎo)致精子數(shù)量的減少。

小鼠精子畸形試驗(yàn)是我國食品、藥品、化妝品等商品進(jìn)行雄性生殖細(xì)胞遺傳毒性安全性評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)方法[8]。精子畸形試驗(yàn)是評價(jià)毒物對雄性生殖毒性及潛在誘變性的一種快速便捷方法,能夠較為客觀地反映精子的形態(tài)發(fā)育情況。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)DEHP染毒后,各劑量組小鼠精子畸形率明顯高于空白組,且隨著DEHP染毒劑量的增大精子畸形率隨之增高,說明一定濃度的DEHP可影響精子的生成和發(fā)育過程,導(dǎo)致精子畸形的發(fā)生,DEHP對雄性小鼠生殖細(xì)胞具有致畸作用,存在著一定的生殖毒性。本次結(jié)果與鄭立[9]和王蕊[10]的文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。