張秀琳， 洪煜婧， 趙枰,*， 陳相， 周峰， 魯曉燕

(1. 南通市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 江蘇 南通 226001； 2. 南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 江蘇 南通 226001； 3. 南通市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 江蘇 南通 226001)

近年來(lái)卵巢癌發(fā)病率不斷上升，且有年輕化的趨勢(shì)，是婦科病死率最高的惡性腫瘤。由于疾病早期缺乏典型的臨床癥狀，患者就診時(shí)多為晚期，雖經(jīng)術(shù)后的聯(lián)合化療，但復(fù)發(fā)率仍很高，預(yù)后差[1-2]。糖類抗原125(CA125)是目前臨床用來(lái)診斷卵巢癌的主要腫瘤標(biāo)志物，但對(duì)早期卵巢癌診斷的特異度和敏感度均不高，尤其是假陽(yáng)性率較高。因此，如何提高早期卵巢癌的檢出率和診斷效率，是目前面臨的主要挑戰(zhàn)。1869年，Ashworth等[3-4]首次提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念，被譽(yù)為“實(shí)時(shí)腫瘤活檢”。本研究采用免疫磁珠為基礎(chǔ)的負(fù)性富集結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)，對(duì)卵巢癌、卵巢良性腫瘤及健康婦女外周血CTCs進(jìn)行定量檢測(cè)，評(píng)價(jià)CTCs在卵巢癌診斷中的價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2015年6月至2016年8月本院收治經(jīng)病理確診的卵巢癌患者65例，年齡41～71歲, 病理分期：按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2014)的分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期9例，Ⅱ期3例，Ⅲ期38例，Ⅳ期15例；同期卵巢良性腫瘤患者21例(囊腺瘤12、子宮內(nèi)膜異位癥4例、巧克力囊腫3例、纖維瘤2例)；健康體檢者10例，年齡42～68歲，無(wú)惡性腫瘤史。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 術(shù)前靜脈穿刺抽血2 mL于無(wú)添加劑的干燥真空管中，Cobas e 601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及原裝進(jìn)口配套試劑(德國(guó)羅氏公司)檢測(cè)血清CA125濃度；7.5 mL于EDTA抗凝管中，24 h內(nèi)進(jìn)行下列檢測(cè)。

1.2.2 CTCs富集 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(上海朗頓生物科技有限公司)提取單個(gè)核細(xì)胞，加入少許紅細(xì)胞裂解液溶解混有的紅細(xì)胞，所得細(xì)胞與Miltenyi磁珠(德國(guó)Miltenyi Biotech公司)混合，加入已潤(rùn)濕的LD柱中，在強(qiáng)磁場(chǎng)作用下收集未吸附的細(xì)胞組份(含CTCs)，LH750全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)計(jì)數(shù)、重懸。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)陽(yáng)性的CTCs 單個(gè)核細(xì)胞懸液經(jīng)固定、并加入透膜劑后，測(cè)定管加單克隆抗體CD45-APC、EpCAM-FITC(德國(guó)Miltenyi Biotech公司)，對(duì)照管加同型對(duì)照，避光孵育，PBS液洗滌，加入多聚甲醛，混勻、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)。每例樣本檢測(cè)(1～2)×104個(gè)細(xì)胞，重復(fù)3次，用BD AccuriTMC6軟件(1.0.264.21)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。以CD45-/EpCAM+細(xì)胞為CTCs，結(jié)果以外周血每106單個(gè)核細(xì)胞中EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表示外周血中的腫瘤細(xì)胞含量，即CTC單位為×10-6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以受試者工作特征(ROC)曲線的曲線下面積(AUC)評(píng)估外周血CTCs檢測(cè)對(duì)卵巢癌的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 ROC曲線評(píng)估外周血CTCs檢測(cè)對(duì)卵巢癌的診斷效能

以術(shù)后病理診斷為“金標(biāo)準(zhǔn)”，以卵巢癌65例為疾病組，以健康體檢者10例及卵巢良性腫瘤患者21例為對(duì)照組(合計(jì)31例)，ROC曲線分析顯示，外周血CTCs檢測(cè)診斷卵巢癌的AUC為0.806(95%CI：0.722～0.890)，最佳臨界值為4.5(>4)個(gè)，敏感度為55.4%，特異度為96.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.3%(圖1)。同樣以術(shù)后病理診斷為“金標(biāo)準(zhǔn)”，以早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)12例為疾病組，以健康體檢者10例及卵巢良性腫瘤患者21例為對(duì)照組(合計(jì)31例)，應(yīng)用ROC曲線分析，外周血CTCs檢測(cè)診斷卵巢癌的AUC為0.679(95%CI：0.473～0.884)，最佳臨界值為5.5(>5)個(gè)，敏感度為41.7%，特異度為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%(圖2)。

圖1 采用外周血CTCs區(qū)分卵巢癌患者和對(duì)照者的ROC曲線

圖2 采用外周血CTCs區(qū)分早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)患者和對(duì)照者的ROC曲線

2.2 血清CA125檢測(cè)對(duì)卵巢癌的診斷效能

以術(shù)后病理診斷為“金標(biāo)準(zhǔn)”，血清CA125水平的正常參考值為<35 U/mL，≥35 U/mL判為陽(yáng)性，即診斷為惡性，各組病例血清CA125濃度見(jiàn)圖3。其診斷早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)和卵巢癌的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為61.5%和91.9%。

圖3 卵巢良性腫瘤和各期卵巢癌患者血清CA125濃度

3 討論

CTCs是指因診療操作或自發(fā)地從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，一般認(rèn)為與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。目前美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)已經(jīng)通過(guò)了對(duì)CellSearch系統(tǒng)的審核，應(yīng)用于乳腺癌等患者外周血CTCs的檢測(cè)[5]。隨后一些學(xué)者應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行了多種惡性腫瘤的研究，結(jié)果表明CTCs對(duì)腫瘤早期篩查、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后判斷都具有特定的臨床應(yīng)用價(jià)值[6-7]。但外周血中CTCs的含量極低，常規(guī)方法難以檢測(cè)。檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，使得分離、富集稀有CTCs成為可能[8]。

本研究首先采用密度梯度離心和紅細(xì)胞裂解的方法提取外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，然后用負(fù)性富集的方法去除單個(gè)核細(xì)胞中的絕大部分CD45+白細(xì)胞；接著用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光標(biāo)記的抗EpCAM特異性抗體以確定EpCAM+的細(xì)胞，認(rèn)為CD45-/EpCAM+的細(xì)胞即為CTCs。國(guó)外有研究表明，用EpCAM作為標(biāo)志可以在卵巢癌患者中確認(rèn)CTCs并有較高的特異性[9]。我們的結(jié)果顯示，外周血中CTCs的含量對(duì)診斷早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)和卵巢癌特異度均較高，可作為一種液體活檢以提高對(duì)卵巢癌的診斷效率。與CA125相比，CTCs診斷早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)和卵巢癌的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均較高，可見(jiàn)CTCs檢測(cè)對(duì)早期卵巢癌表現(xiàn)出很好的診斷價(jià)值，但不可否認(rèn)CA125在靈敏度方面表現(xiàn)更優(yōu)，這與Michael等[10]的研究結(jié)果一致。總之，CTCs檢測(cè)在診斷卵巢癌方面具有較高的特異性和更好的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，可用于卵巢癌的診斷。