張日婷， 張垚， 章安偉， 張烜烽， 嚴(yán)玉蘭

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

巨噬細(xì)胞是一類由血液中單核細(xì)胞分化而來, 具有很強(qiáng)可塑性和多功能性的固有免疫細(xì)胞[1]，當(dāng)體內(nèi)外微環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，可分化為具有不同表型和功能的巨噬細(xì)胞，此過程稱為巨噬細(xì)胞極化[2]。巨噬細(xì)胞可通過經(jīng)典活化途徑極化成M1型巨噬細(xì)胞，或是進(jìn)入替代極化途徑成為M2型巨噬細(xì)胞。

新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)是一種對人類無致病性的溶瘤病毒[3]，可參與多種免疫效應(yīng)[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IFN-λ1的重組新城疫病毒(recombinant NDV expressing human IFN-lambda1, rL-hIFN-λ1)可更強(qiáng)地抑制腫瘤細(xì)胞生長和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡(如肺癌)，同時(shí)可促進(jìn)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生較高水平Th1細(xì)胞因子及抑制Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生[3，6]；但rL-hIFN-λ1在抑制肺癌發(fā)展過程中的具體免疫機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討rL-hIFN-λ1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而調(diào)控外周免疫應(yīng)答實(shí)現(xiàn)抑制肺癌的機(jī)制，并分析不同臨床分期肺癌組織及惡性胸腔積液中巨噬細(xì)胞浸潤表型特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人外周血THP-1單核細(xì)胞系購自美國模式培養(yǎng)物保藏所 (ATCC; Rockville, MD, USA)；rL-hIFN-λ1由本實(shí)驗(yàn)組成員于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱研究所重組[6]。臨床肺癌組織標(biāo)本及胸腔積液標(biāo)本取自2017年1月至2018年1月于江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除的18例肺癌患者。 所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診為肺腺癌。按照國際抗癌聯(lián)盟2017年肺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期各6 例。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶、脂多糖(LPS)、佛波酯、Triton X-100、4%低聚甲醛(美國Sigma公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；IFN-γ、IL-4(美國Peprotech公司)；CD86兔抗鼠單克隆抗體、CD163兔抗鼠單克隆抗體(美國CST公司)；Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG、Cy3標(biāo)記兔抗羊 IgG (美國KPL公司)；IL-2、IL-13、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；Trizol(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；SYBR Premix ExTaq試劑盒(日本TaKaRa公司)；CD86、CD163及內(nèi)參基因 GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；熒光顯微鏡(德國Leica公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(Beckman Du730，美國)；CFX96型實(shí)時(shí)定量PC儀，酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；臺式低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；熒光定量PCR儀(日本TaKaRa公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)

THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素、100 μg/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，孵育于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3 構(gòu)建THP-1來源的M0、M1、M2巨噬細(xì)胞模型

參照文獻(xiàn)[7]報(bào)道的誘導(dǎo)方法將THP-1單核細(xì)胞系(3×105/mL) 鋪于6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)基，加入佛波酯150 ng/mL刺激24 h，誘導(dǎo)其成為M0型巨噬細(xì)胞(未激活型)；在M0基礎(chǔ)上更換培養(yǎng)基，加入LPS(10 pg/mL)、IFN-γ(20 ng/mL)刺激24 h，誘導(dǎo)得到M1型巨噬細(xì)胞(經(jīng)典途徑激活型)；向M0加入IL-4(20ng /mL)刺激24 h，誘導(dǎo)得到M2型巨噬細(xì)胞(替代途徑激活型)，倒置相差顯微鏡觀察3組巨噬細(xì)胞形態(tài)。

1.4 免疫熒光檢測rL-hIFN-λ1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化

用MOI=1.0的rL-hIFN-λ1病毒懸液干預(yù)M0型巨噬細(xì)胞，將得到的rL-hIFN-λ1-M0型巨噬細(xì)胞與M0、M1以及M2 4組巨噬細(xì)胞分別接種于免疫熒光專用培養(yǎng)皿，PBS洗3次×5 min/次；4%低聚甲醛4 ℃固定24 h；PBS 洗3次×5 min/次；0.1% Triton X-100 37 ℃恒溫通透30 min；PBS洗3 次×5 min/次；3% BSA 37 ℃ 封閉30 min。棄封閉液，加入兔抗CD86 抗體(1 ∶200) 、山羊抗CD163抗體(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜；37 ℃復(fù)溫30 min，PBS洗3次×5 min/次；加入Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG (1 ∶800)、Cy3標(biāo)記兔抗羊 IgG (1 ∶800)，37 ℃孵育1 h；PBS洗 3次×5 min/次，核熒光染料Hoechst 33342染色細(xì)胞核；隨后加入防熒光淬滅封片劑，在熒光顯微鏡下以波長569 nm激光激發(fā)紅色熒光，以波長488 nm激發(fā)綠色熒光，并觀察。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：隨機(jī)選取9個(gè)視野，然后進(jìn)行3 次單獨(dú)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將視野中所有細(xì)胞納入統(tǒng)計(jì)計(jì)算結(jié)果。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測巨噬細(xì)胞表型

離心收集上述各組巨噬細(xì)胞，Trizol 法提取各組巨噬細(xì)胞RNA，紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的D(260 nm)/D(280 nm)比值和濃度。根據(jù)說明書將所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后作為模板行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以GADPH為內(nèi)參，檢測各組巨噬細(xì)胞中CD86、CD163 mRNA表達(dá)。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物：5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；CD86上游引物：5′-TGCTCATCTATACACGGTTACC3′；下游引物：5′-TGCATAACACCATCATACTCGA-3′；CD163上游引物：5′-ATCAACCCTGCATCTTTAGACA-3′；下游引物：5′-CTTGTTGTCACATGTGATCCAG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性10 s；95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取均值。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.6 ELISA檢測各型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子

收集各組巨噬細(xì)胞上清液，分別命名為CM-M0、CM-M1、CM-M2、CM-rL-hIFN-λ1，1 000 r/min 離心5 min，取上清液。按照人源 IL-2、IL-13、 IL-10及 TNF-α ELISA 試劑盒說明書操作，測定各組上清液450 nm波長處D值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算上述上清液中各種細(xì)胞因子濃度。每組樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測肺癌組織及胸腔積液中巨噬細(xì)胞表型

收集各組不同臨床分期肺癌組織及胸腔積液，胸腔積液予2 500 r/min離心5 min，棄上清液；標(biāo)本加入4%低聚甲醛固定、脫水、透明，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm切片；石蠟切片經(jīng)二甲苯透明10 min，梯度乙醇脫水。3% H2O2室溫孵育10 min，5% BSA室溫孵育20 min。分別滴加兔抗CD86 抗體(1 ∶200)、山羊抗CD163(1 ∶200)，PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜。次日滴加山羊抗兔IgG-HRP和兔抗山羊IgG-HRP抗體(均1 ∶1 000) ，室溫孵育30 min。PBS沖洗，DAB顯色劑染色，蘇木素復(fù)染2 min，脫水，樹膠封片，鏡檢。使用Image-Pro Plus 6.0掃描肺癌組織及胸腔積液中CD86、CD163平均光密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 THP-1來源各型巨噬細(xì)胞形態(tài)

THP-1誘導(dǎo)分化而來的THP-1-M0型巨噬細(xì)胞由懸浮生長轉(zhuǎn)變成貼壁生長，細(xì)胞大小均一，分布均勻，呈規(guī)則圓形；LPS/IFN-γ誘導(dǎo)分化的THP-1-M1型巨噬細(xì)胞形態(tài)多樣，廣泛聚集貼壁生長，伸出偽足，呈長梭形；IL-4誘導(dǎo)細(xì)胞分化為THP-1-M2 細(xì)胞，同樣呈聚集貼壁生長趨勢，部分伸出偽足，但長梭形細(xì)胞相對較少。3組巨噬細(xì)胞形態(tài)之間存在差異，提示THP-1經(jīng)不同刺激物誘導(dǎo)后可朝向不同類型巨噬細(xì)胞極化。見圖1。

圖1 M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)(相差顯微鏡×400)

2.2 M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD86 mRNA, M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD163 mRNA

qRT-PCR結(jié)果顯示，與THP-1-M0相比，THP-1-M1高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞表型特異標(biāo)志物CD86 mRNA(t=10.51，P<0.01)，THP-1-M2高表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞表型特異性標(biāo)志物CD163 mRNA (t=3.44，P<0.05)。綜上，LPS/IFN-γ和IL-4可分別有效誘導(dǎo)THP-1-M0巨噬細(xì)胞成功分化為M1和M2型巨噬細(xì)胞。見圖2。

a: P<0.01，b: P<0.05

2.3 rL-hIFN-λ1促進(jìn)THP-1-M0巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化

由圖3可見，與THP-1-M0相比，rL-hIFN-λ1誘導(dǎo)得到的巨噬細(xì)胞高表達(dá)M1標(biāo)志物CD86 mRNA(t=4.58，P<0.05)，而低表達(dá)M2標(biāo)志物mRNA(t=2.96，P<0.05)，提示rL-hIFN-λ1可促進(jìn)THP-1-M0巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞而非M2型巨噬細(xì)胞極化。免疫熒光結(jié)果顯示，THP-1-M1型巨噬細(xì)胞CD86陽性率明顯高于THP-1-M2型巨噬細(xì)胞，而CD163陽性率低于THP-1-M2組。同時(shí)rL-hIFN-λ1極化的巨噬細(xì)胞的CD86陽性率同樣高于CD163，進(jìn)一步證實(shí)rL-hIFN-λ1可以促進(jìn)THP-1 M0巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化。見圖4。

圖3 qRT-PCR檢測rL-hIFN-λ1組巨噬細(xì)胞相關(guān)mRNA的表達(dá)

2.4 各型巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌

ELISA檢測結(jié)果顯示，與THP-1-M0組相比，THP-1-M2組巨噬細(xì)胞上清液中IL-10和IL-13表達(dá)明顯增加(t=5.80，8.45，P均<0.01)，TNF-α和IL-2表達(dá)明顯減少(t=3.67，12.92，P均<0.05)，而THP-1-M1組巨噬細(xì)胞上清液則與之相反。同時(shí)，與THP-1-M0組相比，THP-1-rL-hIFN-λ1組上清液中TNF-α和IL-2明顯升高(t=24.74，7.14，P均<0.01)，而IL-10和IL-13表達(dá)明顯降低(t=3.46，19.05，P均<0.05)。見表1。

圖4 各組巨噬細(xì)胞CD86及CD163水平比較

組別IL-2IL-10IL-13TNF-αTHP-1-M051.21±9.1558.14±6.96132.77±19.2541.73±4.34THP-1-M190.13±12.20a42.31±6.13b56.95±13.96a227.88±24.59aTHP-1-M229.31±8.49b77.21±14.89a173.07±11.28a31.02±6.66bTHP-1-rL-hIFN-λ174.64±5.22a44.56±4.93b51.73±6.60b218.15±19.64aF值9.489.306.9842.72P值<0.01<0.01<0.05<0.01

a：P<0.01，b:P<0.05,與THP-1-M0組比較

2.5 肺癌組織及胸腔積液中相關(guān)蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，臨床Ⅰ期肺癌組織中CD86表達(dá)明顯多于Ⅱ、Ⅲ期肺癌組織(t=4.53，6.82，P均<0.01)，而CD163表達(dá)則明顯低于臨床Ⅱ、Ⅲ期肺癌組織(t=3.88，6.39，P均<0.01)；同時(shí)癌性胸腔積液中CD86表達(dá)較CD163表達(dá)少(t=11.19，P<0.01)。由此提示，肺癌的臨床分期進(jìn)展與M1型巨噬細(xì)胞浸潤程度呈負(fù)相關(guān)。見圖5。

圖5 不同臨床分期肺癌組織和胸腔積液中CD86和CD163蛋白的表達(dá)( SP染色×200 )

3 討論

巨噬細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用，在外界不同的刺激下可分別向抑制腫瘤生長的M1型巨噬細(xì)胞和促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答的M2型巨噬細(xì)胞極化[8]。本實(shí)驗(yàn)利用THP-1人源外周血單核淋巴細(xì)胞構(gòu)建巨噬細(xì)胞模型，經(jīng)從形態(tài)到表面分子以及分泌的細(xì)胞因子的檢測，證實(shí)LPS/IFN-γ 和IL-4可以分別誘導(dǎo)THP-1-M0型巨噬細(xì)胞向M1、M2型巨噬細(xì)胞極化，證實(shí)巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性。

研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化可有效抑制腫瘤進(jìn)展。rL-hIFN-λ1是可穩(wěn)定表達(dá)IFN-λ1的新城疫病毒，其受體廣泛存在于CD4+T、PBMCs及NK細(xì)胞，與受體結(jié)合可發(fā)揮類似IFN-γ的作用，促進(jìn)人源巨噬細(xì)胞分泌IL-12 p40調(diào)動機(jī)體免疫應(yīng)答[9-11]，故我們推測rL-hIFN-λ1的抗腫瘤效應(yīng)可能與其能夠促進(jìn)M0型巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，rL-hIFN-λ1能發(fā)揮類似LPS/IFN-γ的作用，誘導(dǎo)THP-1-M0型巨噬細(xì)胞高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86 mRNA，并且釋放M1型巨噬細(xì)胞因子,如IL-2、TNF-α，同時(shí)抑制M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163 mRNA的表達(dá)和抑制M2型巨噬細(xì)胞因子IL-13、 IL-10的釋放，提示 rL-hIFN-λ1具有促進(jìn)M0巨噬細(xì)胞向 M1 極化，抑制其向 M2極化的能力。

浸潤到腫瘤基質(zhì)中的巨噬細(xì)胞主要以M2型為主，又被稱作腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，且與腫瘤的良好預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，而 M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量與良好預(yù)后呈正相關(guān)[8,12]。本研究免疫組化結(jié)果顯示，臨床Ⅰ期肺腺癌組織中浸潤的巨噬細(xì)胞以M1型為主，而臨床Ⅱ期、Ⅲ期肺腺癌組織中以M2型巨噬細(xì)胞浸潤為主，且惡性胸腔積液中也以M2型巨噬細(xì)胞浸潤為主，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。由此提示巨噬細(xì)胞表型與肺腺癌臨床分期及腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)可作為判斷肺腺癌患者臨床預(yù)后的參考指標(biāo)，但巨噬細(xì)胞浸潤表型特點(diǎn)與其他病理類型肺癌臨床預(yù)后之間的相關(guān)性有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，肺癌臨床發(fā)展進(jìn)程與巨噬細(xì)胞浸潤表型密切相關(guān)，rL-hIFN-λ1可促進(jìn)THP-1源巨噬細(xì)胞向M1極化。巨噬細(xì)胞高度的異質(zhì)性和可塑性決定了M1型巨噬細(xì)胞不僅可由M0型巨噬細(xì)胞極化而來，也可以由M2型巨噬細(xì)胞極化而來[13]。因此我們推測rL-hIFN-λ1 不僅可以促進(jìn)M0型巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，還可能誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而減少促腫瘤發(fā)生發(fā)展的M2型比例，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。