陳妮娜， 倪宏

(蘇州大學(xué)兒科臨床研究院， 江蘇 蘇州 215000)

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性的異常放電，導(dǎo)致短暫大腦功能障礙的一種慢性疾病，其特征為反復(fù)發(fā)作、自發(fā)發(fā)作。鋅是體內(nèi)數(shù)百種酶和其他蛋白質(zhì)的重要輔助因子，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程[1]。鋅在腦內(nèi)的分布不均衡，在前腦某些特定的部位濃度最高，如海馬、杏仁核和皮層[2-3]。腦內(nèi)約90%的鋅與金屬硫蛋白結(jié)合，另外約10%的游離鋅存在于突觸前囊泡中，在信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。癲癇的發(fā)作與鋅在體內(nèi)的代謝異常密切相關(guān)，有學(xué)者認(rèn)為癲癇患者血液或者腦脊液中的鋅含量增高[4-5]，但也有學(xué)者報(bào)告是降低的[6-7]。因此，研究鋅代謝異常在癲癇的發(fā)作機(jī)制中具有重要意義。

鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ZnTs)家族有10個(gè)成員，能夠促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)鋅的外流以及使鋅在各細(xì)胞器內(nèi)區(qū)室化改變，從而降低細(xì)胞質(zhì)鋅的含量，對(duì)鋅穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要[8]。ZnT3表達(dá)在含鋅神經(jīng)元的突觸小泡膜上，并將鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸小泡內(nèi)。ZnT3表達(dá)量變化直接影響突觸小泡游離鋅離子的濃度。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品制備大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，以低鋅飲食喂養(yǎng)2周，觀察大鼠二次打擊驚厥閾及死亡率，檢測大鼠大腦皮層ZnT3表達(dá)量，以探討低鋅飲食對(duì)大鼠二次打擊驚厥模型遠(yuǎn)期驚厥閾、死亡率和ZnT3的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只27日齡(P27)健康SD大鼠，雄性，體重80～100 g，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018—0006。在室溫25 ℃，濕度45%環(huán)境喂養(yǎng)，每日12 h光照，自由進(jìn)食和飲用去離子水。

1.2 主要藥品和試劑

氯化鋰(美國Sigma公司)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取127 mg溶于10 mL生理鹽水中備用。匹羅卡品(美國Sigma公司)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取320 mg溶于10 mL生理鹽水中備用。氫溴酸東莨菪堿(Scopolamine hydrobromide,蘇州氬氪氙貿(mào)易有限公司)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取1 mg溶于10 mL生理鹽水中備用。青霉素(華北制藥有限公司)；ZnT3兔多克隆抗體(1 ∶1 000,Synaptic Systems公司)；羊抗兔IgG(聯(lián)科生物科技公司)；鋅測定試劑盒(世紀(jì)沃德生物科技公司)。

1.3 大鼠驚厥持續(xù)狀態(tài)模型的建立

用于制備驚厥模型的雄性成年SD大鼠40只，于P27腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，24 h后即P28腹腔注射氫溴酸東莨菪堿(1 mg/kg)，以減少外周膽堿能反應(yīng)，30 min后腹腔注射匹羅卡品(320 mg/kg)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作。按照Racine分級(jí)[9]，將大鼠行為分為Ⅰ-Ⅴ級(jí)，若給藥后大鼠癇性發(fā)作未到達(dá)Ⅳ級(jí)，則視為誘導(dǎo)失敗。

1.4 動(dòng)物分組與飲食干預(yù)

將60只P27健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組，其中對(duì)照組和低鋅飲食組各10只，驚厥組和驚厥低鋅飲食組共有備用大鼠40只，制備癲癇持續(xù)狀態(tài)模型成功的大鼠隨機(jī)分配到2組中。前2天(即P27、P28)各組均予常鋅飲食(鋅44 mg/kg)喂養(yǎng)，致驚厥后對(duì)照組和驚厥組繼續(xù)予常鋅飲食喂養(yǎng)，低鋅飲食組和驚厥低鋅飲食組予低鋅飲食(鋅 2.7 mg/kg)喂養(yǎng)。喂養(yǎng)2周后予青霉素(劑量為每天5.1×106U/kg)二次打擊，記錄青霉素注射后大鼠首次出現(xiàn)驚厥發(fā)作的時(shí)間(驚厥閾)、死亡時(shí)間及死亡率，觀察時(shí)間為1 h。觀察結(jié)束后取腦組織，冰上迅速分離大腦皮層，裝進(jìn)已標(biāo)記的EP管中，放入-80 ℃冰箱凍存。

1.5 體重及血清鋅濃度檢測

制備驚厥模型后，各組大鼠隔日稱體重。2周后各組大鼠麻醉后心臟采血, 3 000 r/min離心10 min后取上清液于已標(biāo)記的EP管中。按鋅測定試劑盒說明書，取12 μL樣品(血清、鋅標(biāo)準(zhǔn)液及去離子水作為空白)，加入200 μL的試劑一37℃水浴5 min，于570 nm處讀取光密度D1；加入試劑二水浴5 min后讀取D2,△D=D2-D1。樣本濃度=(△D樣品/△D標(biāo)準(zhǔn))×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測大腦皮層ZnT3蛋白表達(dá)

取各組大鼠大腦皮層組織，在冰上充分研磨后加入蛋白裂解液，在超聲細(xì)胞破碎儀中低溫勻漿，15 000 r/min 4 ℃離心30 min，取上清液。用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)測定蛋白濃度，配平。制備10%的SDS-PAGE下層分離膠和5%的上層壓縮膠，上樣體積10 μL，電泳90 min分離ZnT3，100 V轉(zhuǎn)膜60 min，5%脫脂奶粉封閉2 h。加兔多克隆一抗ZnT3(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔IgG室溫下孵育1.5 h，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，成像儀掃描結(jié)果。以Image J軟件計(jì)算各條帶的灰度值，以β-微管蛋白為內(nèi)參，以ZnT3與β-微管蛋白灰度比值作為ZnT3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)驚厥發(fā)作的行為特點(diǎn)

驚厥組和驚厥低鋅飲食組大鼠于腹腔注射匹羅卡品后20～30 min即出現(xiàn)相應(yīng)的外周膽堿能反應(yīng)，主要表現(xiàn)為立毛、呆滯、流涎、結(jié)膜充血等，同時(shí)或者先后出現(xiàn)刻板動(dòng)作，主要表現(xiàn)為面部抽搐、反復(fù)咀嚼、點(diǎn)頭動(dòng)作、濕狗樣抖動(dòng)，同時(shí)或者交替出現(xiàn)單側(cè)或者雙側(cè)的前肢陣攣，后期反復(fù)雙側(cè)前肢陣攣，大鼠出現(xiàn)直立行為，偶可見跌倒發(fā)生，部分大鼠以Racine Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)發(fā)作為首發(fā)表現(xiàn)。對(duì)照組和低鋅飲食組予生理鹽水代替氯化鋰、匹羅卡品腹腔注射，未出現(xiàn)以上發(fā)作行為。本實(shí)驗(yàn)中達(dá)到Ⅳ級(jí)及以上發(fā)作的大鼠有29只，誘導(dǎo)成功率為72.5%(29/40)。誘導(dǎo)成功的老鼠中有4只因全身強(qiáng)直抽搐當(dāng)場死亡，剩余25只隨機(jī)分入驚厥組和驚厥低鋅組，有3只在持續(xù)驚厥后第2天死亡，總死亡率為24.1%(7/29)。驚厥組及驚厥低鋅飲食組各隨機(jī)選出10只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余2只大鼠備用。

2.2 4組大鼠不同日齡體重比較

驚厥前各組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。驚厥第3天、5天、7天驚厥組、驚厥低鋅飲食組體重明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；驚厥第9天驚厥低鋅飲食組體重明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；驚厥第11天、13天、15天各組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。表明驚厥急性期大鼠體重明顯降低，后逐步恢復(fù)增長。

2.3 血清鋅濃度比較

對(duì)照組、低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組大鼠血清鋅濃度分別為(39.04±5.74)、(34.53±7.12)、(31.35±6.38)、(29.89±7.11)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.755，P=0.019)。驚厥組和驚厥低鋅飲食組血清鋅濃度明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低鋅飲食組與對(duì)照組、驚厥低鋅飲食組與驚厥組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明大鼠持續(xù)驚厥后2周血清鋅濃度明顯降低。

表1 各組大鼠不同日齡體重比較 g，n=10

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

2.4 二次打擊后驚厥發(fā)作的行為特點(diǎn)及驚厥閾

2.4.1 二次打擊驚厥發(fā)作的行為特點(diǎn) 喂養(yǎng)第15天大鼠腹腔注射青霉素后約20 min陸續(xù)出現(xiàn)驚厥發(fā)作，表現(xiàn)為活動(dòng)增多、咀嚼、節(jié)律性點(diǎn)頭、甩尾，單雙側(cè)的前肢陣攣、抽搐伴或不伴后肢直立，不協(xié)調(diào)爬行，嚴(yán)重者可出現(xiàn)全身強(qiáng)直—陣攣發(fā)作，四處竄逃并伴有尖叫，最后失去平衡而跌到，甚至死亡。結(jié)果顯示：各組大鼠二次打擊后均出現(xiàn)驚厥發(fā)作，驚厥發(fā)生率為100%。

2.4.2 驚厥閾比較 對(duì)照組、低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組大鼠驚厥閾分別為(43.84±5.40)、(35.02±6.81)、(35.22±6.56)、(27.96±6.83)min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.222,P<0.05)。低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組驚厥閾明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，驚厥低鋅飲食組明顯低于低鋅飲食組和驚厥組(P<0.05)。表明大鼠持續(xù)驚厥后2周再次受到打擊，易感性明顯增加；且低鋅飲食喂養(yǎng)2周亦可使二次打擊時(shí)的易感性增加，二者具有增強(qiáng)效應(yīng)。

2.5 二次打擊后大鼠生存時(shí)間及生存率比較

對(duì)照組、低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組大鼠的生存時(shí)間分別為(57.50±1.73)、(52.06±3.22)、(46.98±4.25)、(36.29±3.89)min，見圖1。經(jīng)log-rank法檢驗(yàn)，驚厥低鋅飲食組生存時(shí)間明顯低于對(duì)照組和低鋅飲食組(χ2分別為9.994、6.707，P<0.05)；低鋅飲食組與對(duì)照組、驚厥低鋅飲食組與驚厥組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為1.204、2.812，P>0.05)。表明低鋅聯(lián)合驚厥處理能明顯減少二次打擊后的生存時(shí)間，二者互為增強(qiáng)作用。各組生存率分別為80%、60%、50%、20%，經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.073)。

圖1 各組大鼠二次打擊后生存時(shí)間比較

2.6 ZnT3在各組大鼠大腦皮層的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，各組大鼠大腦皮層ZnT3蛋白表達(dá)的總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.646，P<0.05)。低鋅飲食組明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，驚厥低鋅飲食組明顯低于驚厥組(P<0.05)，表明低鋅飲食喂養(yǎng)2周可使大鼠大腦皮層ZnT3蛋白表達(dá)降低；驚厥組與對(duì)照組、驚厥低鋅飲食組與低鋅飲食組比較均明顯降低(P<0.05)，表明大鼠持續(xù)驚厥后2周可使大鼠大腦皮層ZnT3蛋白表達(dá)降低。見圖2。

1: 對(duì)照組； 2： 低鋅飲食組； 3： 驚厥組； 4： 驚厥低鋅飲食組。*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與驚厥組比較；△：P<0.05，與低鋅飲食組比較

圖2各組大鼠大腦皮層ZnT3蛋白表達(dá)

3 討論

鋅多分布于海馬的齒狀回苔蘚纖維突觸的囊泡中，在神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)，釋放到突觸間隙，調(diào)節(jié)突觸傳遞。鋅不僅直接結(jié)合突觸后受體，還能進(jìn)入突觸后神經(jīng)元發(fā)揮多種生理功能。鋅能夠發(fā)揮抑制或促進(jìn)神經(jīng)元興奮性的作用，提示可能具有促驚厥和抗驚厥特性。ZnT3對(duì)鋅具有高度專一性，負(fù)責(zé)將鋅轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸囊泡中，再釋放入突觸間隙發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[10]。

本實(shí)驗(yàn)低鋅飼料喂養(yǎng)2周大鼠尚未出現(xiàn)明顯的缺鋅癥狀，如脫毛、脫皮、紅腫、食欲不振等，體重增長未出現(xiàn)明顯緩慢，血清鋅濃度亦未明顯降低。說明低鋅飼料喂養(yǎng)2周，大鼠尚處于代償期，體內(nèi)血清鋅濃度仍較為穩(wěn)定。驚厥后大鼠血清鋅濃度和驚厥閾明顯降低；驚厥聯(lián)合低鋅處理可明顯降低血清鋅濃度、驚厥閾及生存時(shí)間。表明缺鋅可增加癲癇發(fā)作的易感性。

鋅缺乏能增加神經(jīng)損傷、促進(jìn)神經(jīng)元死亡，且可能是通過調(diào)節(jié)ZnT3的表達(dá)量而發(fā)揮作用。在海人酸誘導(dǎo)的癲癇模型中，通過原子光譜分析發(fā)現(xiàn)模型組動(dòng)物海馬和大腦內(nèi)其他區(qū)域的鋅離子減少[11]；ZnT3敲除小鼠比正常小鼠更容易受到紅藻氨酸誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作[12]，且海馬苔蘚纖維鋅離子染色完全缺如；減少突觸鋅可能有助于神經(jīng)元興奮過度，增加熱性驚厥的風(fēng)險(xiǎn)[13]。另有研究表明了矛盾的結(jié)果，在刺激前反復(fù)注射膜透性鋅螯合劑可降低點(diǎn)燃誘發(fā)的癲癇發(fā)作和后放電的持續(xù)時(shí)間[14]。鋅發(fā)揮保護(hù)作用可能需要一個(gè)合適的濃度范圍，超出這個(gè)范圍則發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。

本研究表明缺鋅能增加癲癇發(fā)作的易感性，這種現(xiàn)象可能是低鋅飲食通過下調(diào)ZnT3的表達(dá)，破壞大腦鋅穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致的。本實(shí)驗(yàn)為癲癇發(fā)生與鋅的關(guān)系提供了新的切入點(diǎn)，但尚缺高鋅飲食干預(yù)來探究鋅的合適濃度范圍，仍需更多的研究來揭示鋅與癲癇之間的關(guān)系及相關(guān)的具體機(jī)制。