于垚， 孫輝， 柳益書， 戚欣欣， 劉璐， 孫炳偉

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院燒傷與整形外科， 江蘇 蘇州 215008)

近期研究表明，中性粒細(xì)胞不但可以誘導(dǎo)機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答，還具有免疫抑制功能，引發(fā)免疫耐受，調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫[1]。在膿毒癥的發(fā)展中，部分感染狀態(tài)下的中性粒細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能，通過抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，減少淋巴細(xì)胞對病原菌的殺傷作用，導(dǎo)致膿毒癥死亡率增高[2]。

程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)是一種免疫系統(tǒng)跨膜蛋白，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且與受體PD-1結(jié)合傳遞免疫抑制信號(hào)，使得淋巴細(xì)胞處于“免疫失能”狀態(tài)，幫助腫瘤細(xì)胞逃逸[3-4]。在膿毒癥中中性粒細(xì)胞如何發(fā)揮免疫抑制功能，其是否高表達(dá)PD-L1以及是否通過PD-L1途徑調(diào)節(jié)獲得性免疫尚不完全清楚。本研究通過建立模擬膿毒癥的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，旨在了解和闡明中性粒細(xì)胞如何利用PD-L1發(fā)揮免疫抑制，并探討中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞相互作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美國Sigma公司)，使用前用D-Hank平衡鹽溶解(美國Gibco公司)，母液濃度為1 mg/mL；高糖RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清(美國Gibco公司)；Ficoll-Paque PLUS(美國GE公司)；紅細(xì)胞裂解液，CD3e/CD28功能抗體，PE標(biāo)記鼠抗人CD274抗體，PE標(biāo)記鼠抗人CD69，PE-cy7標(biāo)記鼠抗人CD71，APC標(biāo)記鼠抗人CD3流式抗體，IFN-γ和IL-2 CBA試劑盒，細(xì)胞凋亡試劑盒均為美國BD公司產(chǎn)品；CellTraceTMCFSE 細(xì)胞增殖試劑盒，抗PD-L1功能阻斷性單克隆抗體均為近岸科技有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；其他試劑如果無特殊說明均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 人外周血中性粒細(xì)胞的分離

招募健康成年男性志愿者，采血前2周未服用任何藥物；采集其空腹肘部靜脈血8 mL，置于4個(gè)乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，每管加入2 mL 3%葡聚糖沉降紅細(xì)胞；20 min后取上清液，500×g于15 ℃離心5 min；用6 mL不含Ca2+、Mg2+的HBSS溶液重懸；將等體積的Ficoll-Paque PLUS溶液加入細(xì)胞懸液底部，500×g于15 ℃離心35 min；收集PBMC層用于淋巴細(xì)胞分離，棄去多余上清液；剩余細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液孵育1 min后離心(500×g，15 ℃，5 min)，即得中性粒細(xì)胞。

1.3 人外周血淋巴細(xì)胞的分離

將密度梯度離心后收集的PBMC層離心(500×g，15℃，5 min)后計(jì)數(shù)。每2×107/L個(gè)細(xì)胞加入100 μL 小鼠淋巴細(xì)胞陰選抗體包被孵育20 min；加入5 mL緩沖液，300×g，15 ℃，離心7 min；沉淀的細(xì)胞用與陰選抗體等體積的磁珠抗體重懸，孵育30 min后轉(zhuǎn)入無菌流式管并置于BD IMagant磁力架，靜置6～8 min使磁珠完全吸附。淋巴細(xì)胞為陰性分選，收集未被吸附的細(xì)胞，并用1 mL 緩沖液清洗3次；將收集的液體，500×g，15 ℃，離心5 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞培養(yǎng)

提前12 h用CD3e功能抗體包被96孔U型培養(yǎng)板，用PBS稀釋抗體至5 μg/mL，每孔60 μL；接種細(xì)胞前，將包板的液體吸出。將淋巴細(xì)胞分為4組，對照組，LPS組，中性粒細(xì)胞組，LPS+中性粒細(xì)胞組。對照組：在未干預(yù)過的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；LPS組：用脂多糖(1 μg/mL)與細(xì)胞共培養(yǎng)模擬體外膿毒癥狀態(tài)模型；中性粒細(xì)胞組：按淋巴細(xì)胞 ∶中性粒細(xì)胞為1 ∶2比例共培養(yǎng)；LPS+中性粒細(xì)胞組：將LPS刺激過的中性粒細(xì)胞按淋巴細(xì)胞 ∶中性粒細(xì)胞為1 ∶2比例與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)。保持每孔細(xì)胞數(shù)量為(1～5)×105個(gè)，每孔細(xì)胞體系為200 μL，培養(yǎng)基中加入CD28功能抗體，濃度為2 μg/mL，放入孵箱中培養(yǎng)。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 淋巴細(xì)胞凋亡的檢測 用PBS將96孔U型培養(yǎng)板中的細(xì)胞洗出，離心(300×g，15 ℃，7 min)；棄上清液，加入100 μL PBS溶液重懸；加入4 μL Ly-6G熒光抗體避光室溫孵育20 min；加入1 mL PBS重懸后離心(300×g，15 ℃，7 min)，棄上清液。按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞凋亡率。每組至少重復(fù)3次。

1.5.2 淋巴細(xì)胞增殖的檢測 操作同“1.5.1”，重懸Ly-6G熒光抗體染色后的細(xì)胞，按照細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞的增殖代數(shù)。

1.5.3 淋巴細(xì)胞活力的檢測 用PBS將板中的細(xì)胞洗出，離心(300×g，15 ℃，7 min)，棄上清液；加入100 μL PBS溶液重懸沉淀；分別加入4 μL CD3、CD69、CD71，熒光抗體避光室溫孵育20 min；加入1 mL PBS重懸后離心(300×g，15 ℃，7 min)，棄上清液；用100 μL PBS重懸，用流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞活化比例和平均熒光強(qiáng)度MFI。每組至少重復(fù)3次。

1.5.4 淋巴細(xì)胞炎癥因子濃度的檢測 按照CBA試劑盒操作說明書建立IFN-γ和IL-2的標(biāo)準(zhǔn)品曲線。吸取24、48 h 96孔板中的上清液，按照CBA操作說明書進(jìn)行操作，測量各組樣品中淋巴細(xì)胞IFN-γ和IL-2的濃度。每組至少重復(fù)3次。

1.5.5 中性粒細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的檢測 將中性粒細(xì)胞分為對照組和LPS組，LPS組用1 μg/mL LPS 模擬體外膿毒癥狀態(tài)。將中性粒細(xì)胞按1×106/L密度接種至24孔板，培養(yǎng)12 h；用PBS將2組細(xì)胞從培養(yǎng)板中洗出，離心(300×g，15 ℃，7 min)，棄上清液；加入100 μL PBS溶液重懸沉淀，加入4 μL CD274，熒光抗體避光室溫孵育20 min；加入1 mL PBS重懸后離心(300×g，15 ℃，7 min)，棄上清液；用100 μL PBS重懸沉淀，流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)CD274的中性粒細(xì)胞比例。每組至少重復(fù)3次。

1.5.6 PD-L1單抗對于淋巴細(xì)胞活性影響的檢測 淋巴細(xì)胞按照干預(yù)的PD-L1單抗?jié)舛鹊牟煌譃榈?、中、高濃?組，在中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)體系中分別加入5，10，15 μg/mL的PD-L1單抗，培養(yǎng)24 h；PBS洗滌，離心后(300×g，15 ℃，7 min) 棄上清液，加100 μL PBS溶液重懸沉淀，加入4 μL CD3熒光抗體避光室溫孵育20 min；加入1 mL PBS重懸后離心(300×g，15 ℃，7 min)，棄上清液；用100 μL PBS重懸沉淀。重懸后的細(xì)胞按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞凋亡比例變化

結(jié)果顯示，4組淋巴細(xì)胞凋亡比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=165.00，P<0.05)。與對照組相比，LPS組細(xì)胞凋亡無明顯改變(t=0.63，P>0.05)，中性粒細(xì)胞組(t=21.89，P<0.01)和中性粒細(xì)胞+LPS組(t=30.30，P<0.01) 細(xì)胞凋亡比例顯著增高；與LPS組相比，中性粒細(xì)胞+LPS組細(xì)胞凋亡比例明顯增加(t=34.2，P<0.01)。由此說明，中性粒細(xì)胞可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的凋亡，減弱細(xì)胞活性，在脂多糖刺激作用下抑制作用更為顯著。見圖1。

a：P<0.01，對照組比較；b：P<0.01，與LPS組比較

2.2 淋巴細(xì)胞增殖變化

4組淋巴細(xì)胞增殖的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.40，P<0.05)。與對照組相比，LPS組淋巴細(xì)胞增殖明顯增加(t=4.24，P<0.05)，中性粒細(xì)胞組和LPS+中性粒細(xì)胞組淋巴細(xì)胞增殖明顯降低(t=2.83，P<0.05)；與LPS組和中性粒細(xì)胞組相比，LPS+中性粒細(xì)胞組淋巴細(xì)胞增殖明顯減少(t=8.48，4.23，P<0.05)。由此說明，中性粒細(xì)胞能夠抑制淋巴細(xì)胞增殖，阻止感染狀態(tài)下的淋巴細(xì)胞活化。見圖2。

2.3 淋巴細(xì)胞活化指標(biāo)變化

結(jié)果顯示，各組淋巴細(xì)胞的陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD69陽性率F=54.16，CD69 MFIF=59.66，CD71陽性率F=50.66，CD71 MFIF=40.20；P均<0.05)。與對照組相比，LPS組淋巴細(xì)胞活化指標(biāo)CD69、CD71陽性率和MFI明顯升高；中性粒細(xì)胞組和LPS+中性粒細(xì)胞組CD69、CD71表達(dá)百分比明顯降低，MFI明顯下降(P均<0.05)；與LPS組相比，LPS+中性粒細(xì)胞組淋巴細(xì)胞活化比例明顯降低(P均<0.05)。由此說明，中性粒細(xì)胞能抑制淋巴細(xì)胞的活化，在脂多糖刺激作用下抑制作用更加明顯。見圖3。

a：P<0.05,對照組比較，b：P<0.05，與LPS組比較

a：P<0.05,對照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.4 淋巴細(xì)胞炎癥因子濃度的比較

結(jié)果顯示，各組淋巴細(xì)胞炎癥因子的濃度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( IFN-γ:F24 h=284.70，F(xiàn)48 h=189.60；IL-2:F24 h=206.30，F(xiàn)48 h=296.10；P均<0.05)。與對照組相比，LPS組IFN-γ和IL-2明顯增加，中性粒細(xì)胞組和LPS+中性粒細(xì)胞組淋巴細(xì)胞因子濃度則明顯降低(P均<0.05)，其中LPS+中性粒細(xì)胞組降低最明顯。與LPS組相比，LPS+中性粒細(xì)胞組淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子濃度明顯減少(P均<0.05)。由此說明，脂多糖刺激狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞能明顯抑制淋巴細(xì)胞炎癥因子的釋放。見圖4。

a：P<0.05,對照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.5 中性粒細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，LPS組中性粒細(xì)胞CD274(PD-L1)的表達(dá)明顯高于對照組(t=7.674，P<0.05)。由此說明，在脂多糖刺激的感染狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)升高。見圖5。

2.6 PD-L1單抗對淋巴細(xì)胞活性的恢復(fù)

與對照組相比，低濃度組淋巴細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.12，P>0.05)，而中、高濃度組淋巴細(xì)胞存活率均明顯升高(t=6.41，16.46，P<0.05或<0.01)，呈一定的濃度依賴性。由此說明，阻斷PD-L1能恢復(fù)部分由中性粒細(xì)胞導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞活性抑制，PD-L1通路可能為中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制的關(guān)鍵通路之一。見圖6。

3 討論

中性粒細(xì)胞是人體固有免疫中最重要的免疫細(xì)胞[5]，生理情況下，未被激活的中性粒細(xì)胞在外周血中巡邏，一旦細(xì)菌侵入發(fā)生感染，第一時(shí)間趨化到感染部位，發(fā)揮抗菌抗感染作用[6]。中性粒細(xì)胞具有異質(zhì)性、可塑性，長期生存的同時(shí)具有調(diào)節(jié)獲得性免疫的作用[7-9]。已證實(shí)中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞間的相互作用包括免疫促進(jìn)和免疫抑制，前者涉及直接和間接的抗原遞呈，后者主要涉及抑制淋巴細(xì)胞激活和促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面[10]，具體的機(jī)制尚未完全明確。本研究結(jié)果表明，在膿毒癥嚴(yán)重感染狀態(tài)下中性粒細(xì)胞對淋巴細(xì)胞有免疫抑制的作用，且發(fā)現(xiàn)阻斷PD-L1通路可以逆轉(zhuǎn)免疫抑制狀態(tài)。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組中性粒細(xì)胞表面CD274的表達(dá)

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較

研究發(fā)現(xiàn)，先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)影響著膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[11]。膿毒癥時(shí)的免疫抑制狀態(tài)致病情不斷惡化，目前研究[12]表明膿毒癥的嚴(yán)重程度與免疫細(xì)胞息息相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞有免疫抑制作用，成為一個(gè)可能的膿毒癥時(shí)免疫調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)，通過分析淋巴細(xì)胞凋亡、增殖、活化和細(xì)胞因子釋放4個(gè)方面，發(fā)現(xiàn)膿毒癥狀態(tài)下的中性粒細(xì)胞能促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡，抑制淋巴細(xì)胞增殖、活化以及IFN-γ和IL-2兩種炎癥因子的釋放，發(fā)揮免疫抑制作用，調(diào)節(jié)膿毒癥時(shí)的免疫微環(huán)境，為膿毒癥的免疫治療提供可能。與其他調(diào)控膿毒癥時(shí)淋巴細(xì)胞的研究相比，本研究調(diào)控中性粒細(xì)胞所引起的對免疫穩(wěn)態(tài)的改變遠(yuǎn)小于對淋巴細(xì)胞的調(diào)控，因?yàn)橹行粤＜?xì)胞是一種終末細(xì)胞，受到調(diào)節(jié)的中性粒細(xì)胞在外周血中存活時(shí)間短，免疫治療的不良反應(yīng)少。

近來研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1和PD-1的抗體可以提高膿毒癥小鼠的生存率，阻斷PD-L1和PD-1信號(hào)通路可增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性、減少淋巴細(xì)胞凋亡、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)增加淋巴細(xì)胞因子的釋放，使淋巴細(xì)胞的功能增強(qiáng)[3]。所以阻斷PD-L1和PD-1信號(hào)通路可能成為改善膿毒癥患者生存率的有效治療措施。本研究發(fā)現(xiàn)，與淋巴細(xì)胞相互作用時(shí)，中性粒細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，且在脂多糖刺激后免疫抑制作用更加明顯，與其他研究[13]相一致。此外還發(fā)現(xiàn)，脂多糖刺激后的中性粒細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，且加入PD-L1單克隆抗體阻斷部分PD-L1/PD-1信號(hào)通路可使淋巴細(xì)胞活性增加，并且效果隨著單抗的濃度增加而增強(qiáng)，與他人研究結(jié)果相一致[14]，因此中性粒細(xì)胞很有可能在膿毒癥中通過 PD-L1/PD-1信號(hào)抑制淋巴細(xì)胞作用。本實(shí)驗(yàn)中嘗試使用PD-L1的抗體來阻斷該信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞的活性得到恢復(fù)，凋亡數(shù)量減少，由此推斷，膿毒癥晚期導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞耐受性因素中涉及PD-L1和PD-1的相互作用，但驗(yàn)證僅涉及凋亡這一方面且淋巴細(xì)胞活性僅得到部分恢復(fù)，完全恢復(fù)可能還涉及其他機(jī)制，此外關(guān)于淋巴細(xì)胞其他功能的恢復(fù)，還有待后續(xù)研究。

綜上所述，膿毒癥狀態(tài)下中性粒細(xì)胞抑制淋巴細(xì)胞的活性，包括增加凋亡、抑制增殖、減少活化和抑制炎癥因子釋放；感染狀態(tài)下的中性粒細(xì)胞高表達(dá)PD-L1分子，PD-L1抗體通過阻斷PD-L1/PD-1信號(hào)通路，可以恢復(fù)中性粒細(xì)胞導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞免疫抑制。