丁秀瓊 楊 勁 劉 驍 鄭俏慧 林锏銳 龐曉林

湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 廣東湛江 524000

1前言

實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證是指利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先指定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力[1]。中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）將能力驗(yàn)證作為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的重要手段之一，與現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審構(gòu)成了互為補(bǔ)充的2種能力評(píng)價(jià)技術(shù)[2]。能力驗(yàn)證作為重要的外部質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，尋求并參加能力驗(yàn)證是每個(gè)合格評(píng)定機(jī)構(gòu)的責(zé)任和義務(wù)[1]。實(shí)驗(yàn)室將能力驗(yàn)證用作有效的外部質(zhì)量保證活動(dòng)，并將其作為內(nèi)部質(zhì)量控制程序的補(bǔ)充，持續(xù)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力。

單核細(xì)胞增生李斯特菌，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，是最常見(jiàn)的人畜共患型食源性致病菌之一[3]。人類感染后可導(dǎo)致腸胃炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等，尤其是孕婦、嬰幼兒、老年人及免疫力低下者更易感染[4]。單增李斯特菌廣泛存在于各類乳制品、蔬菜、肉類等食品中，對(duì)人的健康造成了極大的威脅。我國(guó)食品安全國(guó)家致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定熟肉制品及即時(shí)生肉制品中不得檢出單增李斯特菌[5]，世界各國(guó)及地區(qū)也制定了相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)和食品法規(guī)[6]。食品中單增李斯特氏菌的檢測(cè)技術(shù)則成為食源性疾病預(yù)防與控制的關(guān)鍵。為了正確評(píng)價(jià)并提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力和技術(shù)水平，湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室2017年參加了由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局水產(chǎn)品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州）組織的水產(chǎn)品中單增李斯特菌檢測(cè)比對(duì)試驗(yàn)，2018年參加了由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的食品中單增李斯特菌檢測(cè)能力驗(yàn)證，采用國(guó)標(biāo)法、mini VIDAS、實(shí)時(shí)熒光PCR 3種方法對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行檢測(cè)，綜合分析，取得滿意結(jié)果?，F(xiàn)對(duì)3種方法檢測(cè)單增李斯特菌的結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 主要培養(yǎng)基和試劑

李氏增菌肉湯 LB（LB1、LB2）培養(yǎng)基基礎(chǔ)及添加劑、FraserⅠ和FraserⅡ增菌液培養(yǎng)基、PALCAM瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)及添加劑、李斯特菌顯色培養(yǎng)基、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、半固體動(dòng)力培養(yǎng)基、革蘭氏染液、木糖、鼠李糖、血平板均購(gòu)自廣州陸橋檢測(cè)技術(shù)有限公司；單增李斯特菌酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒和VITEK 2格蘭氏陽(yáng)性菌鑒定卡，法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)；單增李斯特菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法），深圳生科原生物股份有限公司生產(chǎn)。

2.1.2 主要儀器設(shè)備

HFsafe-1500 LC型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；GHP—9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；GR110DR型立式高壓蒸汽滅菌器（美國(guó)ZEALWA）Y；DM4B型 leica數(shù)字顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司廣州分公司）。Mini VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析儀、VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）；ABIQ6熒光PCR儀（life technologiesTM）。

2.1.3 試驗(yàn)樣品

2017年水產(chǎn)品中單增李斯特氏菌檢測(cè)比對(duì)試驗(yàn)樣品3個(gè)，樣品標(biāo)識(shí)分別為：PT64、PT83、PT173；ACAS-PT525（2018）食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測(cè)微生物能力驗(yàn)證樣品2個(gè)，樣品標(biāo)識(shí)分別為18-M697和 18-H655。

2.1.4 試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照

單核細(xì)胞增生李斯特菌 （L.monocytogenes），ATCC19111；英諾克李斯特菌（L.innocua），ATCC33 090。

2.2 方法

2.2.1 國(guó)標(biāo)方法

按照組織方提供的《參試指導(dǎo)書》進(jìn)行水化，振搖充分混勻，全部樣品混懸液作為一個(gè)整體樣品，按照GB4789.30-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[7]進(jìn)行增菌、分離、初篩及鑒定。檢驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置陽(yáng)性及陰性菌株對(duì)照。

2.2.2 mini VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析儀

參照GB/T 22429-2008 《食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗(yàn) 酶聯(lián)免疫法》[8]，從樣品FB1增菌液中取1 mL加到9 mL FB2增菌液中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。移取1 mL FB2增菌液加入到小試管中，置沸水浴中加熱15 min，吸取滅活的增菌液 0.5 mL，加入試劑條中，按照儀器使用規(guī)程及試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行上機(jī)操作和判讀結(jié)果。檢測(cè)過(guò)程中按要求設(shè)置試劑盒質(zhì)量控制。

2.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR方法

按照SN/T 1870-2016《出口食品中食源性致病菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[9]進(jìn)行樣品制備、增菌培養(yǎng)。取1mL李氏增菌肉湯（LB2）加到1.5 mL無(wú)菌離心管中，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行模板DNA制備，然后按照儀器使用規(guī)程及試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行上機(jī)操作和判讀結(jié)果。檢測(cè)過(guò)程中按標(biāo)準(zhǔn)要求分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。

3 結(jié)果與分析

3.1 國(guó)標(biāo)法

5個(gè)樣品中的國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果與指定值一致，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果

由表1可見(jiàn)，單增李斯特菌和英諾克李斯特菌在PALCAM平板上的菌落特征基本相同，在李斯特顯色平板上菌落特征有不同，前者有模糊圈，后者無(wú)。單增李斯特菌和伊氏李斯特菌在PALCAM平板上的菌落特征不同，可以區(qū)分，但在李斯特顯色平板上菌落特征一樣。在兩種平板質(zhì)量達(dá)到要求的前提下，兩種平板結(jié)合是可以區(qū)分這幾種李斯特菌的。單增李斯特菌和英諾克李斯特菌木糖、鼠李糖生化反應(yīng)結(jié)果相同，單增李斯特菌和伊氏李斯特菌（L.ivanovii）木糖、鼠李糖生化反應(yīng)結(jié)果不同。全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK2）有時(shí)不能區(qū)分單增李斯特菌和英諾克李斯特菌。本研究中，樣品18-M697鑒定顯示為極好的鑒定，生物編號(hào)142200224733621，結(jié)果為99%L.innocua。樣品18-H655的鑒定結(jié)果顯示為低分辨率，不能區(qū)分單增李斯特菌和英諾克李斯特菌，人工選擇結(jié)果為99%L.monocytogenes，生物編號(hào)142200224733621，和判定為英諾克李斯特菌的菌株有同樣的生物編號(hào)。單增李斯特菌、英諾克李斯特菌和伊氏李斯特菌在血平板上有不同的溶血反應(yīng)，可以很好的區(qū)分。綜合平板菌落特征、生化鑒定和溶血試驗(yàn)判定結(jié)果。

3.2 mini VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析儀

5個(gè)樣品中的mini VIDAS檢測(cè)結(jié)果與指定值一致，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 mini VIDAS檢測(cè)結(jié)果

由表2可見(jiàn)，單增李斯特菌酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒能快速準(zhǔn)確地對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行初篩。mini VIDAS檢測(cè)的特點(diǎn)是只要增菌液存在目標(biāo)菌，不需純培養(yǎng)即可檢出，但無(wú)法判斷目標(biāo)菌的死活，陽(yáng)性結(jié)果需按國(guó)標(biāo)法進(jìn)一步確證，并報(bào)告結(jié)果。

3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR方法

5個(gè)樣品的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果與指定值一致，結(jié)果見(jiàn)表3、圖1、圖2。

由表3可見(jiàn)，單增李斯特菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）能快速準(zhǔn)確地對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行初篩。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的特點(diǎn)是靈敏度高，特異性好，快速高通量，是很好的食源性病原菌初篩方法。若選擇增菌肉湯進(jìn)行初篩，24 h內(nèi)可以有初篩結(jié)果；若選擇平板分離得到的菌落進(jìn)行檢測(cè)，72 h內(nèi)可以得到比較準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

表3 PCR檢測(cè)結(jié)果匯總表

圖1 單增李斯特比對(duì)試驗(yàn)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 單增李斯特菌能力驗(yàn)證熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

能力驗(yàn)證結(jié)果分析表明，國(guó)標(biāo)法是經(jīng)典的檢測(cè)方法，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜，對(duì)檢驗(yàn)人員的檢測(cè)技術(shù)要求高。全自動(dòng)熒光酶聯(lián)免疫法和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)都具有簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)限低、靈敏度高、特異性好及不需純培養(yǎng)即可檢出等特點(diǎn)，是很好的初篩方法，但不排除存在死菌等其他原因造成的假陽(yáng)性結(jié)果，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)位于臨界點(diǎn)不好判定的結(jié)果，需重做或經(jīng)過(guò)國(guó)標(biāo)法確證才能報(bào)告結(jié)果。在能力驗(yàn)證中，組織方都會(huì)添加一種甚至幾種干擾菌，加大了檢測(cè)難度[10]。用國(guó)標(biāo)法檢驗(yàn)，可能出現(xiàn)未挑中目標(biāo)菌落或目標(biāo)菌落生化反應(yīng)不典型等情況，導(dǎo)致未檢出，出現(xiàn)不滿意結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)室條件允許的情況下，3種方法有機(jī)結(jié)合，綜合判斷，可確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。