孫鵬，楊華，程翔，王川，王濤，何永亮，梁尚爭

618000 四川 德陽，德陽市口腔醫(yī)院 口腔頜面外科(孫鵬、楊華、程翔、 王川、王濤);618000 四川 德陽，德陽市第二人民醫(yī)院 病理科(何永亮);646000 四川 瀘州，西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 口腔頜面外科(梁尚爭)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是最常見的口腔頜面部惡性腫瘤，累及消化道的始端，影響進食與功能。OSCC的死亡率為口腔癌之首，危害極大。對于OSCC，目前最主要的治療方法仍為局部切除術(shù)以及頸淋巴清掃術(shù)，但術(shù)后極易復發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。作者通過前期研究發(fā)現(xiàn)Ezrin與OSCC的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關(guān)[2]。吳祥冰等[3]研究發(fā)現(xiàn)HPA的表達上調(diào)參與了OSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，可以作為預測OSCC患者預后的生物標志物。目前國內(nèi)外文獻少有關(guān)于HPA和Ezrin在OSCC中聯(lián)合表達的研究報道。此課題通過檢測HPA和Ezrin在OSCC中的聯(lián)合表達情況，探尋兩者是否能夠預測OSCC患者的預后，并為選擇臨床治療方法提供臨床參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

腫瘤組織為OSCC、癌旁組織(癌灶邊界外1cm處且肉眼觀察大體正常的組織)、正常口腔組織(唇裂修補術(shù)切除的唇部組織及口腔良性病變周圍的組織)。收集德陽市口腔醫(yī)院的OSCC患者標本60例：男性37例，女性23例，均不伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤或嚴重基礎(chǔ)疾病，術(shù)前均未采用放化療；病變部位：牙齦10例，頰部5例，舌部18例，唇部5例，口底22例；術(shù)后病理診斷證實均為OSCC，發(fā)生頸淋巴轉(zhuǎn)移者47例。按WHO OSCC臨床分期標準將所有患者分為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，并將Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期分成兩個組，進行對比研究。癌旁組織15例，正?？谇唤M織15例。

1.2 主要實驗試劑

兔抗人Ezrin、HPA多克隆抗體、超敏試劑盒UltraSensitiveTMSP、即用型DAB(3,3’-diaminobenzidine)顯色試劑盒、即用型抗體稀釋液(Abcam公司，美國)。

1.3 免疫組化染色

采用EnVision兩步法，石蠟切片脫蠟至水，PBS浸泡5分鐘，抗原修復，PBS沖洗3次，3%H2O2室溫孵育15分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗，3分鐘×3次，分別滴加HPA、Ezrin抗體，37℃孵育2小時，3分鐘×3次，0.05%DAB+0.03%H2O2顯色，自來水充分水洗，蘇木素復染，脫水透明封固。染色過程中用己知陽性切片做陽性對照，陰性對照用PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判定

Ezrin：以細胞膜或胞漿中呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞。HPA：以細胞質(zhì)、細胞膜中呈現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性細胞；病理切片染色結(jié)果判定由兩名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師獨立閱片完成，核對結(jié)果并取得共識。采用半定量標準[4]進行判定，即以陽性細胞的百分比和染色強度判定，將每張切片隨機選取5個高倍視野，計數(shù)100個細胞，陽性細胞所占百分比分級標準為：≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；細胞染色強度記分標準：黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；兩者相乘的積：0～1分為陰性(-)；2～6分為陽性(+)；8～12分為強陽性(++)。(-)：不表達;(+)、(++)：陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義則必須P<0.05。聯(lián)合表達相關(guān)性采用Spearman等級因素進行分析，以P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPA、Ezrin在OSCC組織、癌旁組織、正常組織中的表達

Ezrin在3組組織中表達的情況見圖1A、B、C。HPA在3組組織中表達的情況見圖2A、B、C。正常組織組：HPA、Ezrin陽性表達率分別為26.67%、20.00%；癌旁組織組：HPA、Ezrin陽性表達率分別為40.00%、46.67%；OSCC組織組：HPA、Ezrin陽性表達率分別為71.67%、73.33%。結(jié)果顯示：OSCC組織中HPA、Ezrin的表達率高于癌旁組織組和口腔正常組織組，3組間呈現(xiàn)明顯的遞減趨勢，3組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明HPA、Ezrin兩者在OSCC的演變過程中或許扮演著重要角色(表1)。

圖1Ezrin表達情況的免疫組織化學染色

蛋白在細胞膜和胞漿的陽性表達，呈黃色或棕黃色顆粒，如黑色箭頭所示。A，Ezrin在正常組織中的表達(200倍)；B，Ezrin在癌旁組織中的表達情況(200倍)；C，Ezrin在OSCC中的表達情況(200倍)。

Figure1.ExpressionofEzrinbyImmunohistochemicalStaining

The positive expression of protein in membrane and cytoplasm is shown in yellow or tan particles (as indicated by the black arrow). Panel A shows the expression of Ezrin in normal tissue (×200). Panel B shows the expression of Ezrin in adjacent tissue (×200). Panel C shows the expression of Ezrin in OSCC (×200).

圖2HPA表達情況的免疫組織化學染色

蛋白在細胞膜和胞漿的陽性表達，呈棕褐色顆粒，如黑色箭頭所示。A，HPA在正常組織中的表達(200倍)；B，HPA在癌旁組織中的表達情況(200倍)；C，HPA在OSCC中的表達情況(200倍)。

Figure2.ExpressionofHPAbyimmunohistochemicalstaining

The positive expression of protein in membrane and cytoplasm is shown in brown particles (as indicated by the black arrow). Panel A shows the expression of HPA in normal tissue (×200). Panel B shows the expression of HPA in adjacent tissue (×200). Panel C shows the expression of HPA in OSCC (×200).

表1HPA、Ezrin在OSCC組織、癌旁組織、正常組織中的表達(例)

Table1.TheExpressionofHPAandEzrininOSCC,AdjacentandNormalTissue(n)

Groupn-+Positive rate of HPA(%)χ2P-+Positive rate of Ezrin(%)χ2PNormal1511426.6712.6900.00212320.0015.5560.000Adjacent159640.008746.67OSCC60174371.67164473.33

表2HPA、Ezrin在OSCC組織中的表達與臨床參數(shù)的關(guān)系(例)

Table2.TheExpressionofHPAandEzrininOSCCTissueandItsRelationshiptoClinicalParameters(n)

Clinical parameter-+Positive rate of HPA (%)χ2P-+Positive rate of Ezrin (%)χ2PTNM4.3560.0374.0220.045 Ⅰ、Ⅱ111963.30121860.00 Ⅲ、Ⅳ42686.7052583.30Lymph node metastasis9.0110.00310.3200.001 Yes93880.8583982.98 No8533.308538.46

2.2 HPA、Ezrin在OSCC組織中的表達與臨床參數(shù)的關(guān)系

HPA、Ezrin表達：OSCCⅠ～Ⅱ級組表達陽性率為63.3%、60.0%，OSCCⅢ～Ⅳ級組表達陽性率為86.70%、83.30%，分別兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明TNM分期越高其陽性表達率越高，表明OSCC中HPA、Ezrin的表達與其臨床分期相關(guān)；OSCC患者伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達率為80.85%、82.98%，而不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達率為33.30%、38.46%，分別兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明OSCC中HPA、Ezrin蛋白的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表達越高表示發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率越大(表2)。

2.3 OSCC組織中HPA與Ezrin表達的相關(guān)性

通過Spearman相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPA與Ezrin在OSCC組織中的表達存在顯著正相關(guān)(r=0.998，P=0.000，P<0.05)(表3)。

表3HPA、Ezrin在OSCC組織中的表達相關(guān)關(guān)系(例)

Table3.TheCorrelationbetweentheExpressionofHPAandThatofEzrininOSCCTissue(n)

EzrinHPA-+Total+35944-8816Total431760

3 討 論

惡性腫瘤重要的生物學特征是侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤細胞通過穿越由細胞外基質(zhì)和基底膜組成的組織學屏障來完成侵襲和轉(zhuǎn)移。HPA存在于人類多種腫瘤中，與癌細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者的總體生存率呈負相關(guān)[5-6]，參與多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7-9]。研究證實，作為一種癌基因，HPA基因在胰腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，并參與了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10-11]。Vlodavsky等[12]研究證實，HPA基因參與惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制主要為降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖，破壞細胞外基質(zhì)和基底膜的組織學屏障功能，從而促成腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Pisano和Masola的研究組均發(fā)現(xiàn)[13-14]，HPA高表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中扮演重要角色，或可作為腫瘤治療的潛在靶點。吳祥冰等[3]對舌癌患者HPA基因的表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其表達水平均顯著高于正常口腔黏膜上皮細胞，轉(zhuǎn)移病灶組織中HPA基因的mRNA水平和蛋白水平均顯著高于原發(fā)病灶組織，HPA表達與OSCC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，這與本試驗的研究結(jié)果相吻合，說明通過不同的實驗方法得出的結(jié)論相同，增加了實驗結(jié)論的可信度和可靠性。國外學者研究唾液腺腫瘤時發(fā)現(xiàn)[15]，HPA表達水平較高的患者中存活率降低，將HPA作為判斷口腔腫瘤患者預后一個重要指標。王新等[16]研究發(fā)現(xiàn)口腔癌中HPA的表達與癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切有關(guān)。吳祥冰等[3]認為HPA在正?？谇火つそM織為陰性染色，在未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC中呈低表達，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC呈高表達。這與本試驗的結(jié)果得出的結(jié)論具有一致性，即OSCC組織中HPA呈高表達狀態(tài)預示著OSCC患者的臨床分期越高、轉(zhuǎn)移越早、預后越差。

以往的研究證實：Ezrin在OSCC中呈高表達，預示了癌組織的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力越強，預后越差。Ezrin通過磷酸化激活，介導膜與細胞骨架進行連接，使得細胞出現(xiàn)運動、遷移、有絲分裂等，證實Ezrin在細胞的生理功能改變中發(fā)揮重要作用[17]。Ezrin與細胞表面受體相互作用，導致腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落、侵入鄰近組織及脈管系統(tǒng)，破壞基底膜后在靶器官形成轉(zhuǎn)移灶。Ezrin能夠破壞細胞黏附功能，同時破壞E-cadherin，增強腫瘤細胞的運動能力，引起腫瘤細胞脫落，發(fā)生轉(zhuǎn)移。Ezrin還具有減少細胞聚集，增寬細胞間隙，產(chǎn)生偽足，增強其運動能力，使其侵襲力增強的作用[18]。Ezrin具有破壞細胞-細胞間通訊連接使腫瘤轉(zhuǎn)移能力增強的作用[19]，促進由Rho介導的Rho因子參與的信號轉(zhuǎn)導過程，導致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移[20]。

HPA與Ezrin同樣具有促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，其作用機制有所不同，但是結(jié)果一致。本研究結(jié)果示：HPA與Ezrin在OSCC組織中的聯(lián)合表達存在顯著正相關(guān)，兩者在正常口腔組織、癌旁組織、OSCC組織中表達逐步升高，正常組織和癌旁組織之間的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示HPA和Ezrin在OSCC發(fā)生發(fā)展的早期階段即發(fā)生變化,且扮演重要角色。OSCC患者伴有與不伴有頸淋巴轉(zhuǎn)移組之間的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示在OSCC是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程中HPA和Ezrin發(fā)揮重要作用。因本課題在前期研究中發(fā)現(xiàn)Ezrin在OSCC分化程度不同的組間、患者年齡和性別的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，所以在此實驗中沒有將其作為研究對照項目。劉艷華[21]的研究表明：患者的TNM分期越高、組織學分級越高，HPA的表達就越高，提出HPA能夠作為潛在的診斷標志物，具有較高的診斷價值；并通過檢測細胞角蛋白19、乙酰肝素酶在口腔鱗狀細胞癌中的聯(lián)合表達得出兩者聯(lián)合表達更加具有臨床價值。吳國民等[22]研究發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白的表達與OSCC發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，檢測該指標有助于判斷OSCC的病理分級、臨床分期和預后的關(guān)系。由此可見，兩種蛋白的單獨表達均能夠?qū)SCC的病理分級、臨床分期和預后做出預測，兩者同時聯(lián)合表達就能夠提高預測的可靠性和準確性。郭春紅等[23]在對結(jié)直腸癌的研究中應用CDX-2與CK7和CK20的聯(lián)合表達，發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合表達有助于鑒別診斷原發(fā)卵巢癌與結(jié)直腸癌卵巢轉(zhuǎn)移，提高了卵巢轉(zhuǎn)移灶切除的機會，從而延長了結(jié)直腸癌卵巢轉(zhuǎn)移患者的生存期。Sanderson等[24]研究發(fā)現(xiàn)HPA、基質(zhì)金屬蛋白酶-9在腫瘤侵襲、微淋巴管生成中發(fā)揮重要作用，將會成為腫瘤治療的熱點之一。這都充分說明聯(lián)合表達更有利于對腫瘤患者的預后判斷和治療。結(jié)合以往的研究和本次實驗結(jié)果，我們認為HPA與Ezrin的聯(lián)合表達能夠給臨床醫(yī)師對OSCC患者的預后判斷和治療方法的選擇提供參考依據(jù)，提示臨床醫(yī)師在對病變組織(包括癌前病變)進行活體組織檢驗時，就對HPA和Ezrin進行檢測，出現(xiàn)兩者聯(lián)合高表達者，需要擴大切除范圍和/或頸淋巴清掃范圍，術(shù)后配合序列治療，期望獲得較好的預后。

綜上所述，HPA和Ezrin在OSCC的演變過程中扮演重要角色；HPA和Ezrin的表達水平能夠?qū)SCC患者是否具有頸淋巴轉(zhuǎn)移的潛在風險做出預測；兩者在正常組織、癌旁組織、OSCC中的表達呈現(xiàn)逐步增高趨勢，參與了OSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，兩者聯(lián)合表達能夠?qū)SCC患者的預后做出初步預測，并為選擇臨床治療方法提供臨床參考。

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利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關(guān)利益沖突；

學術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學術(shù)不端文獻檢測系統(tǒng)學術(shù)不端檢測；

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