邵偉庚　潘婧　黃利亞　王曉龍

摘要：犬瘟熱是一種急性、烈性、高度接觸性的病毒性傳染病，致死率很高，嚴重威脅多種珍貴野生動物的健康，并對毛皮動物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，探討其基因組的遺傳變異情況極為重要。本研究使用4對特異性引物，采用RT-PCR方法并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析，對犬瘟熱L基因進行特異性分析。結(jié)果表明，CDV-L基因與41株犬瘟熱病毒病的核苷酸和氨基酸同源性分別在92.33%～98.95%和80.93%～98.28%，同時擴增得到的毒株序列與登錄號為KM926612（1992年中國艾鼬）、EU726268（2008年中國水貂）、HM063009（1989年哈薩克斯坦水貂）以及HM046486（2007年哈薩克斯坦海豹）處于同一分支上，這對于該基因型毒株的溯源研究具有一定的意義。

關鍵詞：犬瘟熱病毒；RT-PCR檢測；L基因；序列分析

犬瘟熱（canine distemper，CD）是一種由犬瘟熱病毒（can‘inedistemper virus，CDV）引起的多宿主的烈性、急性、高度接觸性的病毒性傳染病。CDV可引發(fā)多種動物患病，致死率極高。CD分布全球，很多國家和地區(qū)均有報道家養(yǎng)或野生動物感染CD的案例，同時在過去的幾十年中，其感染宿主范圍在不斷擴大。我國很多地區(qū)大型毛皮動物養(yǎng)殖場、動物園甚至保護區(qū)內(nèi)均有動物感染CD而死亡的報道。同時國寶大熊貓、旗艦物種東北虎等多種珍貴野生動物對CDV也高度易感。CD已經(jīng)成為威脅多種野生種群數(shù)量和生存健康的極重要的傳染病。這一系列事件使得對CD研究的重要性日益突出。

1實驗材料

實驗樣本為本室保存的患犬瘟熱的貉子膀胱上皮組織。為避免樣本反復凍融，剪下部分組織分裝于RNase-free 1.5mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2實驗方法

2.1貉犬瘟熱RT-PCR方法檢測

合成4對擴增CDV-L基因的特異性引物（表1），按照Invitrogen公司的總RNA提取試劑盒的操作說明提取病毒基因組總RNA。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄采用20μL體系：5#LRNA模板、3μL RNase free H₂O、1μL dNTPMixture（10mM each）、1μL上游引物（2pmol/μL）。

2.2貉犬瘟熱病毒序列分析

根據(jù)優(yōu)化的反應體系和條件所得，PCR擴增體系為20止：Mix10止，ddH₂O 7μL，上游引物0.5μL（20pmol/μL），下游引物0.5μL（20pmol/μL），cDNA 2μL。反應條件預變性95℃5min；變性95℃30s，退火53℃30s，延伸72℃2min，35個循環(huán)；再延伸72℃10min。

1%瓊脂糖粉凝膠電泳檢測，切膠回收并送測序公司測序。

使用SeqMan和BioEdit軟件將4條序列拼接，并保存為fast格式，選擇ClustalW對其進行多重序列比對，計算貉源犬瘟熱與其他宿主CDV的同源百分比。

將比對結(jié)果導入MEGA 6.0軟件，采用P-distance方法和N-J模型構(gòu)建進化樹，設置Bootstrap值為1000。

3結(jié)果分析

3.1RT-PCR檢測結(jié)果

擴增的CDV-L基因的4條片段長度分別為990bp、900bp、850bD和1025bp，同預測擴增片段相同，如圖1所示。

3.2CDV-L基因序列結(jié)果分析

CDV-L基因與41種有代表性的犬瘟熱病毒病L基因核苷酸同源性在92，33%-98.95%，氨基酸同源性在80.93%-98.28%，與登錄號為KM926612（1992年發(fā)現(xiàn)于中國艾鼬的基因序列）的毒株同源性最高，為98.95%，與登錄號為KM280689（2012年發(fā)現(xiàn)于烏拉圭狼的基因序列）的毒株同源性最低，為92.39%。

所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，可知擴增得到的毒株與登錄號為KM926612（1992年中國艾鼬）、EU726268（2008年中國水貂）、HM063009（1989年哈薩克斯坦水貂）以及HM046486（2007年哈薩克斯坦海豹）處于同一分支上。

4討論

動物感染CDV后致死率極高，甚至可達100%，同時CDV全球均有分布，可感染多種動物，無特定宿主屏障，研究中貉犬瘟熱病毒與艾鼬、水貂、海豹等宿主體內(nèi)檢測的CDV的核酸及氨基酸的同源性較高，并處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支。

本次檢測的4段基因只是CDV全基因組中L基因的部分片段，并不能完全反映整個病毒毒株的特異性，因此在后續(xù)的研究中將會繼續(xù)擴增其它片段，拼接完成后再進行分析，這樣可以更好反映該患病貉CDV的特異性及變異程度。