孫志軍，武 星，彭 暉，李衛(wèi)萍，李虹偉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心臟中心，北京 100050)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是目前導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要疾病之一，糖尿病是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要病因和危險(xiǎn)因素，高血糖可以導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈舒張功能障礙，因此，糖尿病患者的心血管并發(fā)癥與血糖升高有著直接關(guān)系。血管細(xì)胞對(duì)高血糖的早期反應(yīng)是產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。一氧化氮與O2·-在體內(nèi)快速結(jié)合生成的過(guò)氧化亞硝基陰離子(ONOO-)是一種強(qiáng)氧化劑和硝化劑，可促使脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA鏈斷裂和蛋白質(zhì)修飾。研究證實(shí)，高糖可損傷冠狀動(dòng)脈電壓依賴(lài)性鉀離子通道，進(jìn)而影響舒張功能；同時(shí)，冠狀動(dòng)脈在高糖孵育下生成的ONOO-增加，給予尿酸清除ONOO-后，冠狀動(dòng)脈舒張功能得以改善[1]。還有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈管壁氧化負(fù)荷增加，減少氧化負(fù)荷可以改善冠狀動(dòng)脈的舒張功能[1-3]。因此，探討何種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與高糖刺激下的冠狀動(dòng)脈舒張功能受損，將為防治糖尿病心血管并發(fā)癥提供新的治療靶點(diǎn)。

RhoA/ROCK通路通過(guò)調(diào)控平滑肌收縮、細(xì)胞黏附、遷移、增殖和基因表達(dá)等，從而參與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血管痙攣等的發(fā)生。研究顯示，糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈的RhoA mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增高，RhoA/ROCK通路參與了冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞舒縮調(diào)節(jié)作用[4-8]。因此，明確RhoA/ROCK信號(hào)通路是否參與高糖對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞功能的損傷，將為臨床更全面地理解糖尿病的病理生理基礎(chǔ)，尋找更好的糖尿病靶器官損害的治療靶點(diǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠30只，7～8周齡，體質(zhì)量(200.0±20.0)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2主要試劑與儀器RhoA 一抗購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司，ROCK1一抗和ROCK2一抗購(gòu)自美國(guó)SANTA公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗購(gòu)自美國(guó)ProMab公司，Y-27632、C3轉(zhuǎn)移酶、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)和佛司可林均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Powerlab生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)購(gòu)自澳大利亞亞埃德公司，DMT微血管環(huán)張力測(cè)試儀購(gòu)自丹麥DMT公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大鼠冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的制備大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉，注射肝素抗凝，分離心臟后取直徑 ≤200 μm的小冠狀動(dòng)脈，剪取長(zhǎng)約2 mm的血管環(huán)備用。

1.3.2微血管環(huán)收縮舒張反應(yīng)的測(cè)定將血管環(huán)分為正常葡萄糖組、左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組、高葡萄糖+Y-27632組，每組6個(gè)。各組血管環(huán)均在37 ℃條件下培養(yǎng)。正常葡萄糖組血管環(huán)給予5.5 mmol·L-1D-葡萄糖培養(yǎng)24 h；左旋葡萄糖組血管環(huán)給予5.5 mmol·L-1D-葡萄糖和17.5 mmol·L-1L-葡萄糖培養(yǎng)24 h；高葡萄糖組血管環(huán)給予23.0 mmol·L-1D-葡萄糖培養(yǎng)24 h；高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組血管環(huán)給予23.0 mmol·L-1D-葡萄糖培養(yǎng)24 h，C3 轉(zhuǎn)移酶處理 16 h；高葡萄糖+Y-27632組血管環(huán)給予 23.0 mmol·L-1D-葡萄糖培養(yǎng)24 h，Y-27632預(yù)處理16 h。各組分別給予0.1、0.3、1.0、3.0 mmol·L-1的4-AP干預(yù)5 min，觀察血管環(huán)對(duì)4-AP的收縮反應(yīng)；在3.0 mmol·L-1的4-AP使血管環(huán)達(dá)到最大收縮力后給予1 μmol·L-1血管舒張劑佛司可林，觀察血管的舒張反應(yīng)變化(以給藥前后張力變化的百分比表示)。

小冠狀動(dòng)脈的張力測(cè)定方法：將孵育后的冠狀動(dòng)脈環(huán)各穿入2根直徑為40 μm的鎢絲，固定在Multi Myograph System-610M浴槽內(nèi)傳感器上，通過(guò)微血管張力測(cè)試儀的換能系統(tǒng)自動(dòng)采集血管環(huán)的張力變化。

1.3.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)5組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)取制備好的大鼠冠狀動(dòng)脈血管環(huán)分為正常葡萄糖組、左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組、高葡萄糖+Y-27632組，每組3個(gè)血管環(huán)，各組干預(yù)措施同“1.3.2”項(xiàng)，行上述干預(yù)措施后取各組血管環(huán)制備石蠟切片。取各組石蠟切片二甲苯脫蠟2次，每次 5 min；浸入體積分?jǐn)?shù)100%乙醇2次，每次 5 min；浸入體積分?jǐn)?shù)95%、80%、70%、50%乙醇各 5 min；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗10 min。滴加體積分?jǐn)?shù)3% H2O2+PBS孵育10 min；磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline-tween，PBS-T)清洗2次，每次3 min。滴加一抗100 μL，RhoA稀釋度1200；ROCK1稀釋度1200；ROCK2稀釋度1250)，4 ℃過(guò)夜；PBS-T清洗2次，每次3 min。滴加二抗100 μL，室溫下二抗酶標(biāo)結(jié)合反應(yīng)10 min；PBS-T清洗2次，每次3 min。滴加100 μL 二氨基聯(lián)苯胺孵育5 min；蒸餾水沖洗5 min。蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。對(duì)圖片中血管組織采用著色的平均光密度方法來(lái)代表RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白在血管組織中的平均表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1RhoA抑制劑(C3轉(zhuǎn)移酶)和ROCK抑制劑(Y-27632)對(duì)高糖刺激下大鼠冠狀動(dòng)脈舒縮功能的影響各組大鼠小冠狀動(dòng)脈對(duì)4-AP的收縮反應(yīng)均呈濃度依賴(lài)性(圖1)。正常葡萄糖組、左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈對(duì)3.0 mmol·L-1濃度4-AP的收縮力分別為(3.15±0.31)、(2.08±0.17)、(1.37±0.22)、(2.13±0.09)、(2.02±0.16)mN。左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈的收縮力低于正常葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈的收縮力低于左旋葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組、高葡萄糖+Y-27632組與左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈的收縮力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組、高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈的收縮力高于高葡萄糖組(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組與高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈收縮力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

正常葡萄糖組、左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈對(duì)佛司可林的舒張反應(yīng)分別為(48.97±1.77)%、(39.47±1.32)%、(35.20±1.98)%、(39.80±1.59)%、(39.68±1.57)%。左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈的舒張反應(yīng)均低于正常葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈的舒張反應(yīng)低于左旋葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組與左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈舒張反應(yīng)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈舒張反應(yīng)高于高葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組與高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈舒張反應(yīng)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖15組大鼠小冠狀動(dòng)脈對(duì)4-AP的收縮反應(yīng)

Fig.1Contractileresponseofsmallcoronaryarteryofratsto4-APinthefivegroups

2.25組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2和表1。左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA蛋白表達(dá)均高于正常葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA蛋白表達(dá)高于左旋葡萄糖組相，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組、高葡萄糖+Y-27632組、左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA蛋白表達(dá)低于高葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高葡萄糖+Y-27632組與高葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高葡萄糖+Y-27632組與高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

左旋葡萄糖組、高葡萄糖組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK1蛋白表達(dá)均高于正常葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高糖+C3轉(zhuǎn)移酶組與正常葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK1蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高葡萄糖組與左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK1蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK1蛋白表達(dá)顯著低于左旋葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK1蛋白表達(dá)水平顯著低于高葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK1蛋白表達(dá)水平顯著低于高葡萄糖+Y-27632組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK2蛋白表達(dá)均高于正常葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK2蛋白表達(dá)高于左旋葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組、高葡萄糖+Y-27632組、左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK2蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK2蛋白表達(dá)水平低于高葡萄糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組與高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動(dòng)脈中ROCK2蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：正常葡萄糖組；B：左旋葡萄糖組；C：高葡萄糖組；D：高葡萄糖+C3組；E：高葡萄糖+Y-27632組。

圖25組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)(蘇木精染色，×200)

Fig.2ExpressionofRhoA，ROCK1andROCK2proteininthesmallcoronaryarteryofratsinthefivegroups(hematoxylinstaining，×200)

表15組大鼠小冠狀動(dòng)脈中RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)

組別nRhoAROCK1ROCK2正常葡萄糖組 30.175±0.0280.079±0.0070.068±0.002左旋葡萄組 30.249±0.023a0.239±0.005a1.265±0.071a高葡萄糖組 30.314±0.015ab0.218±0.019a3.410±0.048ab高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組30.238±0.022ac0.099±0.012bc0.985±0.338ac高葡萄糖+ Y-27632組 30.273±0.009a0.163±0.011abcd1.562±0.131ac

注：與正常葡萄糖組比較aP<0.05；與左旋葡萄糖組比較bP<0.05；與高葡萄糖組比較cP<0.05；與高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組比較dP<0.05。

3 討論

Rho蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白的成員之一，在細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路中作為分子開(kāi)關(guān)，作用于細(xì)胞骨架或靶蛋白而產(chǎn)生多種生物效應(yīng)[4]。Rho亞家族包括RhoA、RhoB和RhoC 3個(gè)成員。血管緊張素II、5-羥色胺、凝血酶、內(nèi)皮素、血栓素A2、氧化型低密度脂蛋白、腫瘤壞死因子-α及白細(xì)胞介素1-β等均可以激活RhoA[5]。RhoA可以激活不同的下游效應(yīng)器，參與平滑肌細(xì)胞收縮、細(xì)胞黏附、遷移、增殖和基因表達(dá)調(diào)控等，在不同的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路上發(fā)揮生物學(xué)作用。RhoA最重要的下游效應(yīng)器為ROCK，其在細(xì)胞形態(tài)維持、收縮、遷移、黏附、分裂、增殖、凋亡和基因轉(zhuǎn)錄等基本活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[6]。ROCK 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括2種亞型：ROCK1和 ROCK2。有研究顯示，RhoA/ROCK信號(hào)通路在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。高糖可以在系膜細(xì)胞[7]和血管平滑肌細(xì)胞[8]中激活Rho/ROCK 途徑。

有研究顯示，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在高糖(23.0 mmol·L-1)條件下培養(yǎng) 6 h后，可明顯增加 RhoA 活性[9]。大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞在高糖培養(yǎng) 72 h后，可激活 RhoA/ROCK通路，并且這種激活可以被 GF109203X 逆轉(zhuǎn)[10]。研究顯示，高血糖可導(dǎo)致線粒體自由基的大量產(chǎn)生，增加 ROS的生成，促進(jìn)活性氮自由基ONOO-的生成，從而產(chǎn)生毒性作用，引起血管張力和功能障礙[11]。研究表明，RhoA/ROCK通路參與了胰島素抵抗的調(diào)節(jié)和糖穩(wěn)態(tài)的維持[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)給予高糖孵育去內(nèi)皮化的大鼠小冠狀動(dòng)脈24 h，結(jié)果顯示，高葡萄糖組RhoA和ROCK2蛋白表達(dá)顯著增加。同時(shí)高葡萄糖組的小冠狀動(dòng)脈舒張及收縮功能均顯著下降。而左旋葡萄糖組的RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)顯著低于高葡萄糖組，且小冠狀動(dòng)脈的舒張和收縮功能下降程度顯著低于高葡萄糖組。高葡萄糖+C3轉(zhuǎn)移酶組和高葡萄糖+Y27632組小冠狀動(dòng)脈的舒張和收縮功能的下降程度也顯著低于高葡萄糖組，提示ROCK抑制劑可顯著改善高糖所致的平滑肌功能損傷。RhoA/ROCK通路的激活在很大程度上可能與高糖的刺激有直接關(guān)系，而RhoA/ROCK通路的激活導(dǎo)致了大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌功能的受損，因此，推斷RhoA/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了高糖所致的大鼠冠狀動(dòng)脈舒縮功能的受損過(guò)程。

C3轉(zhuǎn)移酶是從梭狀肉毒桿菌提取的一種生物毒素，可催化小三磷酸鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白R(shí)ho在41位天冬酰胺酸的單腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)核糖基化，而該位點(diǎn)是公認(rèn)的Rho蛋白功能區(qū)域，因此，C3轉(zhuǎn)移酶引起的ADP核糖基化可使Rho蛋白失活，可作為RhoA的抑制劑[14]。吡啶類(lèi)衍生物Y-27632是最常用的ROCK抑制劑，其可以滲透入細(xì)胞，結(jié)合到催化部位而抑制ROCK，有效抑制血管平滑肌細(xì)胞的ROCK，對(duì)血管平滑肌有明顯的舒張作用，可降低血壓。Y-27632 對(duì)ROCK的抑制特異性較其他蛋白激酶如蛋白激酶C、環(huán)磷酸腺苷依賴(lài)的蛋白激酶以及肌球蛋白輕鏈激酶等的抑制能力高200倍[15]。

本實(shí)驗(yàn)中分別用RhoA抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶和ROCK抑制劑Y-27632進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示，該2組大鼠小冠狀動(dòng)脈的收縮及舒張功能均較高葡萄糖組有顯著改善。因此，RhoA/ROCK 信號(hào)通路參與高糖致大鼠冠狀動(dòng)脈舒縮功能損傷過(guò)程，表明其在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。