張李榮， 楊海明

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

動(dòng)物腸道寄居著大量微生物，包括細(xì)菌（最多）、古菌、真菌、原蟲和病毒。腸道微生物區(qū)系的形成受個(gè)體、年齡、健康狀況和環(huán)境等多種因素的影響（劉彩虹，2013）。微生物對(duì)宿主腸道結(jié)構(gòu)功能、物質(zhì)消化吸收、腸道免疫調(diào)節(jié)等具有重要影響（Stanley，2014）。 吳娟娟等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，盲腸內(nèi)容物對(duì)無菌雞小腸黏膜、絨毛及脾臟發(fā)育等均有顯著影響，同時(shí)可調(diào)控脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)。周作勇等（2011）研究報(bào)道，雞腸道微生物表面分子結(jié)構(gòu) （PAMPs）可與模式識(shí)別受體PRRs（如Toll樣受體）相互作用，激活相關(guān)免疫信號(hào)路徑。雞盲腸每克糞便大約含有1011個(gè)微生物，同時(shí)與其他腸道相比，盲腸微生物的種類多且復(fù)雜，菌種含量更高，所以盲腸成為了研究焦點(diǎn)（王麗鳳，2013）。目前，微生物研究技術(shù)越來越成熟和多樣化，特別是二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)及運(yùn)用以來，準(zhǔn)確而全面地了解微生物成為可能（Ansorge，2009）。

丁酸鈉是一種新型飼料添加劑，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、維護(hù)腸道健康、平衡腸道菌群和為機(jī)體后腸細(xì)胞提供能量等一系列功能 （陳小兵等，2007）。郭傳珍等（2009）研究表明，飼糧中添加丁酸鈉后，可降低肉雞消化道各段pH及提高腸道后段短鏈脂肪酸濃度，同時(shí)丁酸鈉對(duì)腸道菌群具有明顯的平衡作用。鄒楊等（2010）研究表明，丁酸鈉能夠提高肉仔雞的飼料轉(zhuǎn)化率，改善生產(chǎn)性能，降低腸道pH，且能夠提高腸道揮發(fā)性脂肪酸的含量。因此，本試驗(yàn)選用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，分析飼糧中添加丁酸鈉對(duì)蛋雛雞盲腸微生物的影響，通過微生物豐度和多樣性比較，了解樣本間微生物組成差異，以期能更好地指導(dǎo)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理 羅曼褐蛋公雛由金湖縣永祥種雞有限公司提供。丁酸鈉購自上海麥克林生化科技有限公司。試驗(yàn)在揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行，飼糧參照NRC（1994）營(yíng)養(yǎng)需要配制，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。按常規(guī)飼養(yǎng)和免疫程序進(jìn)行飼養(yǎng)管理，自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取1日齡健康、體重相近的羅曼褐蛋公雛120只，隨機(jī)分成2個(gè)處理組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂添加0.1%丁酸鈉飼糧，試驗(yàn)期42 d。于42 d時(shí)，每個(gè)重復(fù)分別隨機(jī)取6只雞，測(cè)定其生長(zhǎng)性能，再從中選出體重相近且狀態(tài)良好的3只作為測(cè)序樣本，收集盲腸食糜，應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析盲腸微生物。

1.3 樣品采集 選取的雞只處死，在無菌條件下打開腹腔，結(jié)扎盲腸兩端，剪下后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，用無菌剪刀剪開盲腸腸壁，采集食糜置于凍存管中，迅速投入液氮后轉(zhuǎn)至-70℃保存，備用。后將樣品送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行16SrDNA高通量測(cè)序。

1.4 DNA提取和擴(kuò)增 食糜樣品采用OMEGA公司的E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取樣品的總基因組DNA，具體步驟參照說明書，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定性檢測(cè)和測(cè)定濃度。以提取的DNA為模板，對(duì)16SrDNA V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的通用引物序列：341F（CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG）和 805R（G ACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGAC TACHVGGGTATCTAATCC）。 擴(kuò)增體系 30 μL：2×Taq master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F（10 μM）1 μL，Primer R （10 μM）1 μL，模板 DNA 20 ng。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min，5 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，45 ℃20 s，65 ℃ 30 s），20 個(gè)循環(huán) （94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72℃ 30 s），72℃延伸5 min。 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用Agencourt AMPure XP試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并回收，利用Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量。采用標(biāo)準(zhǔn)Illumina TruSeq DNA文庫制備流程構(gòu)建所需的宏基因組上機(jī)文庫，測(cè)序系統(tǒng)為Illumina MiSeq平臺(tái)，最終上機(jī)測(cè)序濃度為20 pmol。1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 用CASAVA對(duì)原始圖像數(shù)據(jù)文件進(jìn)行堿基識(shí)別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（Raw Data）。再通過去雜拼接、質(zhì)量控制、篩選并去除嵌合體序列步驟后，使用Usearch軟件將干凈序列按97%相似水平聚類成操作分類單元。計(jì)算豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)，并進(jìn)行熱圖和主成分分析，利用R軟件作圖。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS19.0，進(jìn)行方差分析（ANOVA），以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 丁酸鈉對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能的影響 由表2可知，飼糧中添加丁酸鈉對(duì)蛋雛雞的體重、平均日增重（ADG）、料肉比均無顯著影響（P ＞ 0.05），但丁酸鈉組各指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，丁酸鈉組平均日采食量（ADFI）顯著降低 1.52%（P ＜ 0.05）。

表2 丁酸鈉對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 盲腸食糜測(cè)序結(jié)果 由表3可知，對(duì)兩組盲腸食糜樣品進(jìn)行測(cè)序，分別獲得52153和60027條平均原始序列，在97%相似水平上分別平均歸類成997和1008個(gè)操作分類單元。構(gòu)建稀釋性曲線，由圖1可知，隨著測(cè)序深度的增加，曲線趨于平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)具有合理性，各樣本能夠真實(shí)反映微生物組成情況。

表3 盲腸食糜測(cè)序結(jié)果

圖1 稀釋曲線

2.3 門水平分析 由表4可知，兩組雛雞盲腸菌群主要存在厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，合計(jì)分別占99.39%、97.98%。兩組間變形菌門含量差異極顯著（P ＜ 0.01），Synergistetes（互養(yǎng)菌門）含量差異顯著 （P＜0.05）。變形菌門含量較對(duì)照組降低44.8%。同時(shí)，兩組存在一定量放線菌門和極少量的疣微菌門。

表4 盲腸菌群門水平分布

2.4 屬水平分析 由表5可知，在屬水平上，兩組主要存在擬桿菌屬、Faecalibacterium、瘤胃球菌屬、梭菌XⅣa類群、梭菌Ⅳ類群、Barnesiella等菌屬。其中，擬桿菌屬、梭菌XⅣa類群、Dorea、梭菌XⅧa類群等菌屬的含量存在顯著差異。同時(shí)，與對(duì)照組相比，丁酸鈉組乳酸桿菌屬顯著提高38.6%（P＜0.05）。埃希氏菌屬/志賀氏菌屬含量極顯著降低71.4%（P＜0.01）。未歸類菌屬含量差異極顯著（P ＜ 0.01）。

表5 盲腸菌群屬水平分布

2.5 Alpha多樣性分析 本文選用 Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)和覆蓋率來評(píng)估樣本中微生物Alpha多樣性。Ace和Chao1指數(shù)用來估計(jì)物種豐度；Shannon和Simpson指數(shù)用來估計(jì)微生物多樣性，多衡量群落異質(zhì)性，兩者值越大，則說明群落多樣性越高。Coverage指數(shù)表示各樣品文庫的覆蓋率，實(shí)際反映了本次測(cè)序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況。

由表6可知，兩組覆蓋率均為0.99，接近于1，說明兩組數(shù)據(jù)結(jié)果能反映真實(shí)菌群情況。從Chao1和Ace指數(shù)上看，丁酸鈉組菌群豐度大于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。同時(shí)，與對(duì)照組相比，丁酸鈉組Shannon和Simpson指數(shù)均顯著大于對(duì)照組（P＜0.05）。綜上說明，飼糧中添加丁酸鈉后，雛雞盲腸微生物不僅豐度增加，而且菌群多樣性也顯著提高，微生物種類更多，均勻性更高。

表6 盲腸微生物Alpha多樣性分析

2.6 Heatmap圖和PCA分析 Heatmap圖 （圖2-A）顯示了不同處理組盲腸菌群屬水平物種豐度，顏色從紅到藍(lán)，代表菌種豐度由低到高。由聚類樹可知，各組樣本具有較好的相似性。同時(shí)，對(duì)不同樣本進(jìn)行了主成分分析（PCA），由 PCA（圖2-B）分析可知，第一主成分方差貢獻(xiàn)率為45.57%，第二主成分方差貢獻(xiàn)率為38.61%，累計(jì)為84.18%。對(duì)照組和丁酸鈉組的樣本點(diǎn)分布區(qū)域不同，說明處理間群落構(gòu)成存在差異性。

圖 2 盲腸微生物Heatmap分析圖（A）和主成分分析PCA圖（B）

3 討論

研究表明，厚壁菌門、擬桿菌門和變形桿菌門是雞和火雞胃腸道最大的細(xì)菌門類，超過總數(shù)的 90%（Wei，2013）。 林奕岑等（2016）通過高通量測(cè)序技術(shù)分析肉雞盲腸微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)前三位共享菌門分別為擬桿菌門（70.0%）、厚壁菌門（25.4%）、變形菌門（4.3%）。本研究顯示，兩組雛雞盲腸菌群主要存在厚壁菌門、擬桿菌門及變形菌門3種，這與前人研究的結(jié)果類似。目前有學(xué)者認(rèn)為，厚壁菌門和擬桿菌門兩者含量的比例能夠影響機(jī)體對(duì)能量的吸收。Turnbaugh等（2006）在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠腸道富集厚壁菌門細(xì)菌，而擁有更高比例的擬桿菌門細(xì)菌小鼠相對(duì)瘦削。這可能是因?yàn)楹癖诰T細(xì)菌富含淀粉、半乳糖及丁酸等代謝酶，有助于促進(jìn)機(jī)體對(duì)能量的吸收，更利于脂肪的沉積（Murphy，2010）。本試驗(yàn)中，丁酸鈉對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能改善效果明顯，但厚壁菌門和擬桿菌門的含量未顯示有顯著變化（P＞0.05），推測(cè)可能是由試驗(yàn)動(dòng)物、添加量、劑型及試驗(yàn)誤差等因素造成的。變形菌門是細(xì)菌域中最大的一門，其中包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等。本試驗(yàn)中變形菌門含量顯著降低（P＜0.05），說明丁酸鈉具有很好的平衡腸道菌群的作用。另外，組間互養(yǎng)菌門含量差異顯著（P＜0.05）?；ヰB(yǎng)菌門是一種較新分類門，屬革蘭氏陰性厭氧桿菌，具有降解氨基酸和丙酮酸的能力。Li等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，互養(yǎng)菌門可能對(duì)鵝的盲腸具有重要影響，這有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在屬水平上，丁酸鈉組擬桿菌屬、Faecalibacterium、梭菌 XⅣa類群、梭菌Ⅳ類群、梭菌XⅧa類群等菌屬含量均有一定程度提高。這與孫喆等（2017）研究結(jié)果類似，其在探討酵母發(fā)酵培養(yǎng)物對(duì)內(nèi)仔雞盲腸菌群的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)盲腸內(nèi)容物中以擬桿菌屬、Faecalibacterium、乳酸桿菌屬為主。梭菌是廣泛存在腸道的共生菌，屬于組成厚壁菌門的核心菌類，由多種復(fù)雜的異質(zhì)菌種構(gòu)成，分類的主要特征是革蘭氏陽性、桿狀及能形成芽孢（Collins，1994）。梭菌具有很強(qiáng)的發(fā)酵能力，產(chǎn)生的丁酸可優(yōu)先被結(jié)腸上皮細(xì)胞吸收利用，為機(jī)體提供能量，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，加速腸黏膜的修復(fù)，調(diào)控腸上皮細(xì)胞的基因表達(dá)。Mu等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，纖維飼料可顯著提高豬結(jié)腸梭菌XⅧa類群豐度和丁酰輔酶A的含量。同時(shí)，Ivanov等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，梭菌XⅣa類群、梭菌Ⅳ類群、梭菌XⅧ能夠誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞17（Th17）增殖分化，Th17能夠分泌IL17、IL22等免疫因子，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起重要的作用。其含量變化可能指示機(jī)體的健康狀況，F(xiàn)rank 等（2007）研究報(bào)道，炎癥性腸?。↖BD）患者腸道梭菌XⅣa類群含量顯著低于健康受試者。Russell等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，萬古霉素治療的小鼠腸道梭菌XⅣa、梭菌Ⅳ含量減少，從而加重小鼠過敏性哮喘。值得注意的是，有報(bào)道顯示梭菌類群能夠機(jī)會(huì)性感染宿主，但這可能是部分或單個(gè)菌種在宿主免疫功能降低時(shí)造成的，而并不具有強(qiáng)致病感染能力（Nava，2011）。以上結(jié)果說明，飼糧中添加丁酸鈉有助于雛雞盲腸發(fā)酵菌的增殖，使機(jī)體擁有更強(qiáng)的發(fā)酵能力。另外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加丁酸鈉可顯著提高有益菌乳酸桿菌屬含量（P＜0.05），而極顯著降低有害菌埃希氏菌屬/志賀氏菌屬的含量（P＜0.01）。乳桿菌屬具有促進(jìn)腸道屏障發(fā)育、調(diào)節(jié)腸道免疫功能、降低腹瀉風(fēng)險(xiǎn)等功能。志賀氏菌屬根據(jù)抗原可分為四類，可引起細(xì)菌性痢疾，而管家基因的測(cè)序表明，志賀氏菌屬應(yīng)該和腸侵襲性E.coli（EIEC）歸為一類，兩者都能以相同方式入侵腸道，從而引起疾?。˙eld，2012）。說明丁酸鈉能夠促進(jìn)有益菌增殖而抑制有害菌繁殖。

研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體在疾病或應(yīng)激狀態(tài)下，腸道菌群種類和數(shù)量都會(huì)下降（李永洙，2015）。而本試驗(yàn)通過Alpha多樣性分析，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉能夠提高雛雞盲腸微生物豐度，顯著提高微生物多樣性（P＜0.05）。這也與Heatmap和PCA分析結(jié)果相驗(yàn)證，即兩組微生物存在差異性。說明通過添加丁酸鈉可重新平衡腸道菌群，以提高雛雞盲腸菌群種類和改善微生物均勻性，使雛雞對(duì)抗不良因素的能力增強(qiáng)。

4 小結(jié)

飼糧中添加丁酸鈉有利于促進(jìn)雛雞生長(zhǎng)，且能平衡腸道菌群，提高菌群豐度和多樣性，使微生物種類更多，均勻性更好。