么宗利，衣曉飛，來琦芳，周 凱，高鵬程

(中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，鹽堿地漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 200090)

動物機體必須有效排泄蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物氨(NH3和NH4+)來避免其在體內(nèi)積累中毒。為避免氨中毒，陸生動物消耗大量能量將氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩峄蚰蛩嘏判埂Ｈ欢鷦游锇ù蟛糠拄~類直接將氮廢物以氨的形式排泄。在排氨過程中，外界水環(huán)境作為“氨槽(ammonia pool)”使魚體內(nèi)的氨連續(xù)排出[1]。魚類如何排泄有毒蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物(主要是氨和尿素)一直是魚類生理學領(lǐng)域研究的焦點問題[2]。除了排尿素的軟骨魚類和一些特殊硬骨魚類(如海灣豹蟾魚Opsanusbeta[3]和馬加迪湖羅非魚Oreochromisalcalicusgraham[4])以尿素形式排泄氮代謝產(chǎn)物外，魚類在水環(huán)境中主要以氨的形式排泄蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物[5]。最初人們認為，氨和尿素主要依靠分壓和濃度梯度經(jīng)組織上皮排泄到體外，后來研究發(fā)現(xiàn)它們的排泄需要借助載體蛋白：氨排泄依賴Rh等蛋白[6]，尿素排泄依賴Ut (Urea transporter)等蛋白[7-9]。氨和尿素排泄是氮平衡和蛋白質(zhì)代謝重要指標[10- 11]。研究表明，魚類氮排泄受pH[12- 13]、鹽度[14]、堿度[4, 15- 16]、溫度[17]、體質(zhì)量[18]、攝食[5]以及運動[5]等多種因素的影響，其中鹽度和堿度是影響氮排泄的主要因素。為此，本文總結(jié)了不同水環(huán)境中魚類的氮排泄機制及鹽堿脅迫對氮排泄的影響，并提出了今后的研究方向，以期為鹽堿水環(huán)境中魚類氮排泄機制研究提供參考。

1 魚類氮排泄一般規(guī)律

氮廢物排泄是魚類物質(zhì)和能量代謝的重要環(huán)節(jié)，氨和尿素是蛋白和核苷酸代謝的重要產(chǎn)物，也是魚類氮廢物排泄的主要形式[19- 20]，表1列出了典型水環(huán)境中不同氮排泄形式的代表性魚類。其它氮代謝產(chǎn)物包括尿酸、肌酸酐、蛋白質(zhì)[21]、硝酸鹽、亞硝酸鹽[22]及某些胺類化合物[23]。魚類氮廢物排泄受氮攝入量、水體pH、鹽度、溫度、環(huán)境NH3等多種因素的影響[19]。

表1 不同類型水環(huán)境魚類氮排泄形式Fig.1 Fish nitrogen excretion in different types of water

1.1 氨排泄

氨是魚類氮代謝的主要終產(chǎn)物，它主要由肝臟、腎臟和肌肉中的α-氨基酸經(jīng)脫氨基作用產(chǎn)生[31- 32]。海水和淡水硬骨魚在水中以氨氮形式排泄氮廢物，氨氮占總氮廢物排泄的60%～95%[33]。以氨氮形式排泄氮廢物是硬骨魚最快、也是最經(jīng)濟的排泄形式[34- 35]。氨不但能以非離子形式的NH3排泄，還可以離子形式的NH4+排泄。與排泄尿素、尿酸相比，魚類排氨有許多優(yōu)點：可溶性大、低耗能，此外在淡水魚類中NH4+與Na+的離子交換在維持水鹽平衡中發(fā)揮重要作用[32, 36]。硬骨魚中80%～90%的氨從鰓排泄[35, 37-40]，只有少量氨通過腎臟以尿液形式排出。NAKADA等[41]定位了鰓上的4種Rhesus(Rh)糖蛋白(Rhag，Rhbg，Rhcg1，Rhcg2)，并證明這些Rh糖蛋白參與了鰓中氨的排泄。當遇到特殊環(huán)境，一些魚也可以通過皮膚排泄氨，有研究發(fā)現(xiàn)潮間帶的穴棲無眉鳚(Lipophryspholis)在干露環(huán)境中通過皮膚排泄的氨提高到45%，鰓排氨功能減弱[34]；虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在高氨環(huán)境中也能通過皮膚轉(zhuǎn)運氨[42]。魚類氨排泄已經(jīng)研究了80多年，但是相關(guān)機制仍然存在爭議。最初人們認為魚類的氨排泄僅依靠自由擴散，在細菌、酵母以及植物細胞中具有氨轉(zhuǎn)運功能的Rh蛋白的發(fā)現(xiàn)以及魚類鰓Rh基因和蛋白的發(fā)現(xiàn)為研究鰓中氨排泄機制打開了新局面[36]。氨主要以非游離的NH3形式排泄[43-44]。NH3沿著血液-水擴散梯度穿過鰓上皮的磷脂雙分子層擴散出去[35, 45]，氨的排泄率由鰓內(nèi)外NH3分壓梯度決定[46]。

基于淡水魚Rh蛋白相關(guān)研究，WRIGHT等[36]提出了一種氨排泄模型，在這一模型中， Rhag協(xié)助NH3順氨濃度梯度從紅細胞中排出。NH3在基底外側(cè)膜Rhbg的作用下穿過基底膜進入鰓上皮細胞，頂端膜上的Rhcg將其轉(zhuǎn)移到水環(huán)境中。NH3一旦進入水中，就與通過H+-ATPase和Na+,H+交換蛋白泵出的H+結(jié)合形成NH4+。這種氨泵保持了血液-水的氨分壓(PNH3)梯度，為Na+吸收提供了電化學驅(qū)動力。此外，細胞內(nèi)的碳酸酐酶、基底外側(cè)的Na+,HCO3-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白和Na+,K+-ATPase間接地作用于氨轉(zhuǎn)運。氨的轉(zhuǎn)運可能還依賴于水邊界層的酸捕獲機制，而酸捕獲機制中的H+可由CO2代謝產(chǎn)生[36]。

與淡水相比，海水中Na+的濃度高出兩個數(shù)量級。海水的高緩沖能力使進出鰓的水pH變化比淡水魚小[47-48]。在細胞和分子水平，海水魚和淡水魚的離子調(diào)控有很大不同[49]，有文獻證明海水魚鰓中NH4+的擴散比淡水魚更重要[50]。NAKADA等[41]定位了河鲀Rh糖蛋白并推測鰓小片上皮細胞基底膜Rhbg和頂膜的Rhcg2促進NH3擴散，頂膜Rhcg1與通過Na+,K+(NH4+)-ATPase進入鰓小片線粒體富集細胞(MRCs)的NH4+相偶聯(lián)也促進NH3排出鰓。但是關(guān)于NH4+擴散對凈排泄的貢獻尚有待進一步研究。雖然也有少數(shù)關(guān)于海水魚氨排泄機制的研究[51]，但是關(guān)于海水魚的氨排泄模型還需進一步探索。

1.2 尿素排泄

尿素的產(chǎn)生部位主要是肝臟和白肌[52]。在這些組織中尿素可以通過鳥氨酸尿素循環(huán)(OUC)以及分解精氨酸和尿酸產(chǎn)生[53-54]。鳥氨酸尿素循環(huán)是尿素的合成途徑，而精氨酸和尿酸是通過分解作用產(chǎn)生尿素。鑒定排尿素魚類的標準就是測定其肝臟和肌肉中是否存在OUC酶[谷氨酸合成酶(GS)、氨甲酰磷酸合成酶III(CPSIII)、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶]活性[55]。OUC基因在很多排氨魚中被保留，但在大部分組織中表達量很低[53, 56]，這種保留有利于一些排氨魚類在胚胎期排泄尿素以減少胚胎發(fā)育期的氨毒性[57-58]。

在淡水和海水硬骨魚中，氨占氮廢物排泄的60%～95%，其余大多以尿素形式排泄[33, 54]。大部分硬骨魚是非泌尿和非排泄尿素的。只有廣鹽性的軟骨魚[59-60]以及非常少的硬骨魚如海灣豹蟾魚(Opsanusbeta)[61]、馬加迪湖羅非魚(Alcolapiagrahami)[62]排泄尿素，其中后者是已知的100%排尿素魚類[4, 63- 64]，非洲肺魚(Protopterusannectans)在正常條件下泌尿排氨[65-66]。另外，一些在成魚階段排氨的硬骨魚(如虹鱒)，在胚胎時期也會以尿素形式排泄氮廢物。皮質(zhì)醇激素在調(diào)節(jié)氨和尿素的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用，它能夠調(diào)節(jié)海灣豹蟾魚的尿素排泄[67]。

一般魚類的尿素排泄發(fā)生在含有較多尿素轉(zhuǎn)運蛋白的鰓部，這些轉(zhuǎn)運蛋白類似哺乳動物腎臟中的尿素轉(zhuǎn)運蛋白(Uts)[52, 59]。尿素不是持續(xù)排泄的，而是以間隔脈沖的方式從鰓中排出，1～2 d發(fā)生一次，持續(xù)0.5～3 h，這表明鰓細胞膜上相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的活動是周期性的[61]。另外還有少量的尿素以尿液形式從腎臟排出，在腎小管中尿素的重吸收與Na+吸收相耦合[68]。

先前許多學者認為尿素排泄是通過細胞膜擴散轉(zhuǎn)運，隨著研究手段的進步，有研究發(fā)現(xiàn)尿素通過鰓上尿素轉(zhuǎn)運蛋白Ut排泄[69]。最初Ut基因的表達在斑馬魚(Daniorerio)中被證明，BRAUN等[70]采用Ut基因表達沉默技術(shù)，使斑馬魚尿素排泄減少90%，明確了轉(zhuǎn)運蛋白和尿素轉(zhuǎn)運之間的關(guān)系。除了通過尿素轉(zhuǎn)運蛋白排泄尿素，Na+,Urea交換是第二種轉(zhuǎn)運方式，這種方式能夠保留尿素并維持體內(nèi)尿素水平[71]。

2 堿度和鹽度對氮廢物排泄的影響

2.1 堿度對氨排泄的影響

淡水硬骨魚轉(zhuǎn)移到堿水環(huán)境下排氨率會立即降低，血漿氨濃度升高[43, 72- 73]，而且隨著脅迫時間延長，這種關(guān)系更加明顯[74]。造成排氨率降低的原因是，氨排泄主要依賴鰓兩側(cè)的NH3濃度梯度通過鰓基底膜和頂膜上的Rh糖蛋白轉(zhuǎn)運[36]，排氨率由NH3分壓梯度決定[75]。高堿度導致鰓邊界層用于捕獲NH3合成NH4+的H+減少[48]。從NH3+H+NH4+(pK=9.5，15 ℃)可以看出，當環(huán)境中水的pH升高時，相應(yīng)鰓外側(cè)水pH升高，使H+濃度降低，NH3NH4+反應(yīng)朝向NH3側(cè)進行。水中pH升高降低了ΔpH，表現(xiàn)為機體排氨率降低[72]；另一原因是堿水直接作用于鰓的Na+,NH4+轉(zhuǎn)運蛋白，但考慮到NH3擴散在淡水魚的排氨率中占支配地位，后者的影響可能極小[76- 77]。

2.2 堿度對尿素排泄的影響

堿性環(huán)境抑制氨的排泄，然而對尿素的排泄卻有促進作用，例如馬加迪湖羅非魚在高堿度環(huán)境中以尿素形式排泄所有氮廢物。但是在多數(shù)魚類，堿度升高對尿素排泄的增加只是瞬間的[78]。WILKIE等[29]研究證明克拉克大馬哈魚為適應(yīng)pH 9.4的環(huán)境，可能通過提高尿酸分解來增強它們依賴的尿素排泄。同樣，虹鱒也缺少鳥氨酸尿素循環(huán)功能，在pH 9.5時尿素排泄率加倍。需要強調(diào)的是，這種升高的尿素排泄是暫時的，在暴露于高pH 2～3 d后就不復(fù)存在[30]。

2.3 鹽度對氮排泄的影響

鹽度對氨排泄的影響主要通過影響能量代謝和Na+,NH4+交換實現(xiàn)。魚類在等滲點時滲透調(diào)節(jié)壓力最小，代謝率最低，生長率最高，此時維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的滲透壓調(diào)節(jié)耗能最少。而遠離等滲點時需要消耗更多的能量用于滲透壓調(diào)節(jié)。當鹽度導致代謝率增大時，排氨率也隨之增加。可能的原因是水生動物對糖類的利用率較低，主要靠蛋白質(zhì)代謝提供能量，增加的耗能主要靠蛋白質(zhì)脫氨基作用提供[71]。 此外，為了維持生物體的水鹽平衡，鰓上皮具有維持體內(nèi)Na+穩(wěn)定性的Na+,NH4+交換系統(tǒng)，需要在NH4+的參與下工作，因此環(huán)境滲透壓的變化也會在一定程度上導致氨氮排泄率的變化。

鹽度主要通過改變滲透壓影響尿素排泄。在軟骨魚中，尿素作為主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，組成了大于40%的血漿滲透壓[2]。魚體對血漿尿素含量在正常海水環(huán)境和鹽度變化時都必須嚴格監(jiān)管。合成尿素需要消耗大量能量，通過復(fù)雜的代謝產(chǎn)率、攝食獲取、鈉耦合的腎臟再吸收及鰓定向梯度維持保留尿素[79]。有學者推測軟骨魚在鹽度變化時不僅需要離子調(diào)節(jié)，還需要代謝和攝食調(diào)控，這些都要改變滲透物質(zhì)如尿素等的濃度，它們可能比硬骨魚對變化的鹽度適應(yīng)速度慢，這也說明了硬骨魚更容易適應(yīng)鹽度變化[80]。在硬骨魚中，尿素作為滲透物質(zhì)的作用很小，因此預(yù)測鹽度對硬骨魚尿素排泄的影響很小。例如馬加迪湖羅非魚血漿中尿素含量很低，從50%海水轉(zhuǎn)移到淡水的過程中并沒有消除尿素排泄[81]。排尿素的海灣蟾魚能耐受較大的鹽度范圍，當脅迫鹽度范圍為20%～200%的海水時，血漿滲透壓占總滲透壓的比例變化僅為2.4%～5.2%，尿素排泄率保持相對穩(wěn)定[82]。因此，即使鹽度變化，尿素作為滲透物質(zhì)在硬骨魚中的作用也很小，鹽度對硬骨魚尿素排泄的影響不大。

3 鹽堿環(huán)境下魚類氮廢物排泄策略

大多數(shù)硬骨魚類對體內(nèi)氨水平較敏感[71]。而在諸如凡湖(Van Golu)、馬加迪湖(Lake Magadi)、皮拉米德湖(Pyramid Lake)、青海湖(Lake Qinghai)等鹽堿度較高的極端環(huán)境中，馬加迪湖羅非魚、克拉克大馬哈魚、土耳其塔氏卡拉白魚(Chalcalburnustarichi)、虹鱒以及青海湖裸鯉等都進化出應(yīng)對排氨壓力的調(diào)節(jié)機制[83]。雖然這些耐堿魚類面臨相同的挑戰(zhàn)，但它們各自進化出了獨特的耐堿機制來應(yīng)對極端堿性環(huán)境。

3.1 重建NH3分壓梯度——虹鱒、土耳其卡拉白魚的耐堿機制之一

在中性環(huán)境中，虹鱒90%的氮廢物通過鰓排泄，其中氨排泄占85%，尿素排泄一般只占10%～20%[33]。堿性環(huán)境使血液中氨濃度升高，同時血液pH升高，從而幫助虹鱒重新建立血液-鰓外側(cè)水NH3分壓梯度(ΔPNH3)。因此在高pH脅迫下，1～2d后虹鱒會恢復(fù)到脅迫前的氨排泄水平[84- 85]。在更加極端的情況下，當NH3和NH4+的濃度急劇升高或者達到毒性水平，體內(nèi)升高的NH3可能會導致高pH[29, 85]以及Na+和Cl-濃度降低誘導的死亡[86]。凡湖中土耳其塔氏卡拉白魚血液中高氨水平導致其排氨率極高，可達1 000μmol·(kg·h)-1。研究推測在凡湖堿水中，這種高血氨水平能夠促進氨排泄的ΔPNH3形成[72]。然而因為土耳其塔氏卡拉白魚生活在60%海水鹽度的湖水中，它可能依賴NH4+促進氮排泄，而非NH3。

3.2 轉(zhuǎn)變氮代謝產(chǎn)物

3.2.1 尿素排泄——馬加迪湖羅非魚、克拉克大馬哈魚的耐堿機制之一

馬加迪湖羅非魚、克拉克大馬哈魚等進化出特殊機制來解決在堿性環(huán)境中的排氨問題。

最極端的例子是馬加迪湖羅非魚，它以尿素形式排泄所有的氮廢物[4, 63, 87- 88]，這種特例是因為馬加迪湖羅非魚存在一套完整活躍的鳥氨酸尿素循環(huán)輔酶。雖然大部分硬骨魚都存在鳥氨酸尿素循環(huán)輔酶基因，但關(guān)鍵酶通常無活性，或者說缺失某些關(guān)鍵基因[89- 90]。因此很多硬骨魚產(chǎn)生尿素是通過尿酸分解、嘌呤降解或者是由飲食中精氨酸代謝產(chǎn)生[33, 91]。海灣豹蟾魚和印度囊鰓鯰也可以通過鳥氨酸循環(huán)將氨轉(zhuǎn)換為低毒的尿素，然后以尿素的形式排泄部分或全部的氮廢物[92- 93]。

克拉克大馬哈魚在皮拉米德鹽堿湖(pH 9.4)中大約25%～30%的氮廢物以尿素形式排泄，比典型的淡水硬骨魚稍高[94- 95]，但鳥氨酸尿素循環(huán)的關(guān)鍵酶比如氨甲酰磷酸合成酶Ⅲ含量太低不足以表明鳥氨酸尿素循環(huán)的存在。實際上，重要的尿酸分解酶活性表明尿素是通過典型的尿酸分解途徑產(chǎn)生[29, 96]。

土耳其塔氏卡拉白魚37%的含氮廢物是以尿素形式排泄，但是它沒有鳥氨酸尿素循環(huán)途徑[97]。因此，這種魚的尿素生產(chǎn)可能是通過尿酸分解。

瞬間尿素排泄率的提高可能是克拉克大馬哈魚對環(huán)境急性pH升高的一種普通的氨解毒反應(yīng)。WILKIE等[30, 98]證明克拉克大馬哈魚可以適應(yīng)pH為9.4的環(huán)境，但pH達到10會受到挑戰(zhàn)，可能通過提高尿酸分解率來提高它們依賴的尿素排泄。同樣的，虹鱒也缺少鳥氨酸尿素循環(huán)功能，在pH為9.5時尿素排泄率加倍。需要強調(diào)的是，這種升高的尿素排泄是暫時的，在高pH環(huán)境中2～3 d后就不復(fù)存在[30, 98]。

3.2.2 轉(zhuǎn)變?yōu)榘被帷獜椡眶~、蟾魚等的耐堿機制之一

研究表明當堿性環(huán)境造成體內(nèi)氨濃度升高時，一些魚類將氨轉(zhuǎn)變成氨基酸儲存起來，尤其是谷氨酰胺[4]。谷氨酰胺在氨運載中是一種非常重要的無毒產(chǎn)物。彈涂魚(Periophthalmuscantonensis)和海灣豹蟾魚在腦部可以通過它們特別強大的谷氨酸脫氫酶/谷氨酰胺合成酶解毒系統(tǒng)將氨轉(zhuǎn)換成自由氨基酸以耐受體內(nèi)的高氨含量，這些組織對氨中毒極其敏感[99]。彈涂魚還可以利用部分氨基酸代謝產(chǎn)生ATP，而利用丙氨酸作為臨時的氨槽，因此沒有氨釋放到環(huán)境中[100]。

3.3 高氨耐受能力——馬加迪湖羅非魚、土耳其塔氏卡拉白魚等的耐堿機制之一

高氨耐受能力也是有助于魚類生活在高堿度環(huán)境中的關(guān)鍵策略。根據(jù)尿素排泄機制，馬加迪湖羅非魚可能擁有高氨耐受能力。馬加迪湖羅非魚NH3的LC50大約比大部分硬骨魚高6倍，這種高氨耐受能力大多與肝臟中谷氨酰胺合成酶的高活性有關(guān)[101]。哺乳類和魚類的一種典型的解氨毒反應(yīng)就是谷氨酰胺合成酶催化NH4+和谷氨酸合成谷氨酰胺。高谷氨酰胺合成能力對馬加迪湖羅非魚也是非常重要的，因為它提供了尿素形成所必須的OUC酶：氨甲酰磷酸合成酶Ⅲ和谷氨酰胺合成酶[91, 93]。

土耳其塔氏卡拉白魚也表現(xiàn)出高氨耐受力，其血液(1 mmol·L-1)和肌肉組織(12 mmol·L-1)中能積累高濃度氨。而典型的硬骨魚肌肉和血漿中氨濃度范圍通常在0.6～2.0 mmol·kg-1和50～200μmol·L-1[102- 103]。高尿素排泄率提示其具有較高的尿素生產(chǎn)效率，以及腦部高谷氨酰胺合成酶活性，這可使土耳其塔氏卡拉白魚擁有不尋常的高氨耐受力[97]。

3.4 其它途徑——克拉克大馬哈魚的耐堿機制之一

克拉克大馬哈魚從幼體生活的淡水水域(pH 8.4)轉(zhuǎn)移到皮拉米德湖(pH 9.7)中會永久地降低氮廢物生產(chǎn)率，而不是依靠提高尿素排泄或者對血液氨水平有極高耐受力，這種降低體現(xiàn)在血漿氨濃度短暫的升高和氨排泄長期的降低。結(jié)果使克拉克大馬哈魚在轉(zhuǎn)移到皮拉米德湖后避免了體內(nèi)氨潛在的毒性。皮拉米德湖克拉克大馬哈魚可能是通過抑制代謝速率或者依賴其它能源物質(zhì)例如糖類或脂類降低氨生產(chǎn)[98]。另一可能途徑是克拉克大馬哈魚完全抑制了氮代謝，以另一種物質(zhì)排泄替代了氮廢物。尿素或尿酸并不是替代物質(zhì)，但是有可能克拉克大馬哈魚在轉(zhuǎn)移到皮拉米德湖后排泄了相當多的谷氨酰胺、氧化三甲胺、肌酸或者其它的氮廢物[96]。

4 展望

關(guān)于淡水魚和海水魚在它們各自生存環(huán)境中的氮排泄機制已較清晰，然而對生活在鹽堿這一特殊環(huán)境下魚類的氮排泄機制研究相對較少，尚未總結(jié)出耐鹽堿魚類的氮排泄模型。我國擁有豐富的耐鹽堿水生生物資源，為鹽堿適應(yīng)生理機制的研究提供了優(yōu)良的實驗材料，尤其是一些鹽堿湖中生存有耐鹽堿土著魚類，如青海湖裸鯉[104]、瓦氏雅羅魚等[105]。雖然前期對青海湖裸鯉、瓦氏雅羅魚的氮排泄規(guī)律進行了探索，比如發(fā)現(xiàn)在高堿環(huán)境下青海湖裸鯉表現(xiàn)為暫時性呼吸性堿中毒[106]，裸鯉在高堿環(huán)境下前期氮廢物排泄受到抑制、但后期會通過啟動Rh基因高表達恢復(fù)氨氮排泄，同時啟動Ut高表達來增加尿素氮排泄來進行氮廢物排泄[16]；高堿環(huán)境下瓦氏雅羅魚排氨率下降、血漿中非必需氨基酸的含量升高、Rhcg1和Rhcg2基因表達上調(diào)[28]。但有關(guān)耐鹽堿魚類的氮排泄機制仍有待于深入研究。對我國的耐鹽堿魚進行氮排泄的研究將有助于構(gòu)建鹽堿水中魚類的氮排泄機制模型，為揭示魚類的耐鹽堿機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。