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(1.北京工商大學(xué)理學(xué)院,植物資源研究與開發(fā)重點實驗室,北京 100083；2.北京工商大學(xué),食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100083)

仙人掌(OpuntiadilleniiHaw)屬仙人掌科仙人掌屬植物,是熱帶及亞熱帶植物,多生長于美洲及墨西哥干旱荒漠或者是半荒漠地區(qū),其中以墨西哥分布最多。我國主要分布在廣西、江西、廣東、福建、海南等地。仙人掌用途廣泛,如食用、做觀賞植物、藥用等。趙學(xué)敏所著的《本草綱目拾遺》中記載,仙人掌可作為藥用植物,其具有清熱解毒、安神利尿、行氣活血、消腫止痛、健脾止瀉的功效,可內(nèi)服,亦可外用治療疾病。

仙人掌內(nèi)豐富的仙人掌多糖(Opuntiadilleniipolysaccharide,ODP)是其有諸多功效的主要原因之一。ODP主要從仙人掌的果實和莖里提取而來,極性大分子化合物葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖是其主要組成物質(zhì)。目前,ODP的抗氧化、抗炎抑菌、免疫、降血糖血脂、抗腫瘤、護(hù)肝[1-10]等多種功效都已被證實。除上述的藥理功能,ODP還可防脫發(fā)[11],治療神經(jīng)退行性疾病藥物[12],促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能[13]。如今,仙人掌應(yīng)用愈加廣泛,如:市面上已有仙人掌制的果蔬汁、保健品和面粉制品出售。

傳統(tǒng)的提取多糖的方法如包含水提、堿提、酸提、苯酚提取、微波輔助提取、超聲輔助提取和酶提等方法[14],存在多糖提取率低,純度不高,原料浪費嚴(yán)重,且影響對多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和功效鑒定等問題[15]。本實驗采用微生物法提取多糖,是利用微生物在生長過程中,會利用其他營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長,但并不利用多糖對植物多糖進(jìn)行去雜純化,反應(yīng)條件溫和且能耗少。此外,因新鮮仙人掌肥厚的肉質(zhì)莖含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、纖維素和維生素C等,同時含有豐富的SOD、黃酮類及多糖等活性功能成分[16],所以本實驗采用新鮮的仙人掌葉片來進(jìn)行試驗。本文研究將從以下兩個方面進(jìn)行:一是用乳酸菌、酵母菌發(fā)酵新鮮仙人掌來探究ODP提取工藝;二是用發(fā)酵得到的多糖液做抗炎實驗,探究ODP的抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮仙人掌 生長期為3～8個月,云南白藥集團(tuán)公司;硫酸、苯酚、葡萄糖(均為國產(chǎn)分析純) 北京化工廠;乳酸菌 北京川秀科技有限公司;酵母菌 中國科學(xué)院微生物所;Hacat細(xì)胞 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 中德化妝品研究所 細(xì)胞毒理實驗室;水、過濾超純水 實驗室制備。

BS2202S 型電子天平、A2492型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HR2195攪拌機勻漿機 飛利浦有限公司;YZB-蘇(錫)1132-2004低速大容量離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;DSHZ-300恒溫水浴振蕩器 江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠;電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠;WJ-80A-ⅡCO2培養(yǎng)箱 上海圣科;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、板,凍存管 美國Corning/Costar;ABI7300型熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;SW-CJ-1D超凈工作臺 上海啟前電子科技有限公司;Enduro水平電泳儀 美國Labnet公司;Sigma 1-14微型離心機 德國Sigma;Sigma3-30K高速臺式冷凍離心機 德國Sigma;GeneAmp PCR System 9700 PCR儀 美國ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ODP提取工藝 新鮮仙人掌莖洗凈、去刺、去皮后切碎,用勻漿機勻漿2 min,再進(jìn)行高壓滅菌(120 ℃,30 min),在超凈臺將加入4 mL菌液加入100 mL仙人掌勻漿液中后用封口膜封口,于空氣搖床(180 r/min)培養(yǎng),而后離心(20000 r/min,10 min)取上清,用旋蒸儀將上清液濃縮至原體積的1/3,再以3倍體積95%乙醇醇沉12 h,再一次離心(20000 r/min,10 min),取沉淀熱水(60 ℃)溶解得粗多糖液。

1.2.2 ODP含量測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:參照苯酚硫酸法[17],結(jié)果顯示在0～120 μg/mL濃度范圍內(nèi),葡萄糖與A490呈良好的線性關(guān)系,以吸光度對多糖濃度C進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程:y=0.0151x+0.0042(R2=0.9996),y表示吸光度值A(chǔ)490,x表示仙人掌多糖的濃度,μg/mL。

ODP樣品含量測定:取兩只帶塞試管,分別吸取1 mL待測液和1 mL去離子水,再分別依次添加0.5 mL 5%苯酚,搖勻后加入2.5 mL濃硫酸,蓋上試管蓋,再充分搖勻,靜置5 min后,置于水浴鍋中沸水浴1 h,測定吸光值A(chǔ)490。并根據(jù)回歸方程計算ODP濃度。

ODP得率(%)=所得的ODP濃度×仙人掌多糖液體積/仙人掌的質(zhì)量×100

老師要鉆研教材，讀懂教材，尋找讀寫結(jié)合點，設(shè)計寫話梯度，給學(xué)生一個抓手，讓學(xué)生寫有所仿，創(chuàng)能有法，實現(xiàn)省時高效的寫作訓(xùn)練。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵法的單因素實驗

1.2.3.1 時間對多糖得率的影響 將提取的液料比固定為20∶1 (mL/g),溫度固定為35 ℃,pH固定為7,選取5個時間梯度5、6、7、8、9 h,作為探究乳酸菌發(fā)酵提取時間的單因素條件,取一定量的多糖溶液,測定該因素下提取得到的多糖含量,從而計算得到多糖得率。

1.2.3.2 液料比對多糖得率的影響 將提取時間固定為7 h,pH固定為7,溫度固定為35 ℃,選取5個液料比梯度10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g),作為探究乳酸菌發(fā)酵提取液料比的單因素條件,取一定量的多糖溶液,測定該因素下提取得到的多糖含量,從而計算得到多糖得率。

1.2.3.3 pH對多糖得率的影響 將提取的液料比固定為20∶1 (mL/g),溫度固定為35 ℃,時間固定為7 h,選取5個pH梯度為3、4、5、6、7,作為探究乳酸菌發(fā)酵提取pH的單因素條件,取一定量的多糖溶液,測定該因素下提取得到的多糖含量,從而計算得到多糖得率。

按以上實驗所得的最佳單因素條件進(jìn)行實驗,計算最大的仙人掌多糖得率。

1.2.4 酵母菌發(fā)酵法的單因素實驗

1.2.4.1 時間對多糖得率的影響 將提取的液料比固定為20∶1 (mL/g),發(fā)酵溫度固定為28 ℃,pH固定為5.5,選取5個時間梯度24、36、48、60、72 h作為探究黃酒酵母發(fā)酵提取時間的單因素條件,取一定量的多糖溶液,測定該因素下提取得到的多糖含量,從而計算得到多糖得率。

1.2.4.2 液料比對多糖得率的影響 將提取時間固定為48 h,pH固定為5.5,溫度固定為28 ℃,選取5個液料比梯度10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g),作為探究黃酒酵母發(fā)酵提取液料比的單因素條件,取一定量的多糖溶液,測定該因素下提取得到的多糖含量,從而計算得到多糖得率。

1.2.4.3 pH對多糖得率的影響 將提取的液料比固定為25∶1 (mL/g),溫度固定為28 ℃,時間固定為48 h,選取5個pH梯度3、4、5、6、7作為探究黃酒酵母發(fā)酵提取pH的單因素條件,取一定量的多糖溶液,測定該因素下提取得到的多糖含量,從而計算得到多糖得率。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) 凍存人表皮永生化細(xì)胞(Hacat細(xì)胞)從-80 ℃的冰箱中取出后,迅速37 ℃水浴,輕微震動1～2 min使其徹底融化。1000 r/min離心10 min,棄上清。加1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium,DMEM),轉(zhuǎn)移到10 cm2培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃ 5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。細(xì)胞生長到90%融合時,動作輕柔地用2 mL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗兩次。加200 μL 0.25%胰酶后,放入CO2培養(yǎng)箱中消化5 min,在觀察確認(rèn)細(xì)胞已從培養(yǎng)瓶壁上脫落后,加2 mL的完全培養(yǎng)液終止消化,800 r/min離心l0 min,去上清液,加入4 mL培養(yǎng)液,計數(shù)后,以5×105密度接種于10 cm2培養(yǎng)瓶。

1.2.6 MTT法測定Hacat細(xì)胞毒性實驗 選取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的Hacat細(xì)胞。用0.25%胰蛋白酶將Hacat細(xì)胞消化,1500 r/min離心1 min后重懸于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,計數(shù);用96孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞,并設(shè)置空白對照,邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)填充,在5% CO2,37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)12 h;按照各自終濃度分別加入ODP,細(xì)胞對照組是未做處理的組,每組設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)44 h后,加入5 g/L的MTT溶液,繼續(xù)在37 ℃,5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng);吸除孔內(nèi)液體,用PBS洗滌1次,加入DMSO溶解結(jié)晶;M3讀板儀測定各孔吸光度值A(chǔ)570。分別用0.5、1、2、2.5、5 mg/mL ODP處理Hacat細(xì)胞。

Hacat細(xì)胞存活率(%)=(測定孔吸光度值- 空白對照組吸光度值)/(細(xì)胞對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100

1.2.7 ODP處理時間對炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8基因表達(dá)的影響 將消化后的細(xì)胞(消化方法參照1.2.5),以2×106/孔的密度接種6孔板內(nèi),以0.5 mg/mL的ODP處理細(xì)胞不同時間(0、0.5、1、1.5、2 h)。提取細(xì)胞總RNA,熒光定量分析處理對炎癥細(xì)胞因子在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響,內(nèi)參基因定為β-actin。

1.2.8 炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的測定

1.2.8.1 細(xì)胞總RNA提取與檢測 總RNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA,參照文獻(xiàn)[18-19] 。

1.2.8.2 cDNA第一鏈合成 使用TINAGEN Fast QuantRTKit(With gDNase)FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒(去基因組)進(jìn)行cDNA第一條鏈合成反應(yīng)。將得到的cDNA中加1000 μL ddH2O,稀釋混勻,-20 ℃保存。

1.2.8.3 引物及探針的設(shè)計和合成 根據(jù)NCBI發(fā)布的IL-6、IL-8等基因的序列,用PrimerExpress軟件設(shè)計特異性引物,同時設(shè)計管家基因β-actin的特異性引物?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 Real-Time PCR引物序列Table 1 Primer sequences for Real-Time PCR

1.2.8.4 實時熒光定量PCR 以cDNA為模板,反應(yīng)體系為20 μL,其中PrimeScriptRTEnzyme MIX 10.4 μL,ddH2O 7.6 μL,正向、反向引物各0.5 μL,cDNA模板1 μL,使用ABI7300熒光定量PCR儀擴(kuò)增實驗樣本,擴(kuò)增條件為95 ℃ 2 min預(yù)變性,然后按95 ℃ 15 s,57 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,做42個循環(huán),在72 ℃收集熒光信號。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理重復(fù)三次,用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,應(yīng)用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵提取多糖單因素實驗

2.1.1 時間對得率的影響 按照方法1.2.3.1探究不同發(fā)酵時間對ODP得率的影響,結(jié)果見圖1,隨著時間增加,得率顯著性增加(p<0.05),7 h時最大為0.25%,而后得率變化不顯著(p>0.05)。這是由于提取時間短時,ODP溶出不完全,乳酸菌生長還處于遲緩期或?qū)?shù)期,而提取時間長,乳酸菌會隨著時間的增長而逐漸衰亡,從而失去活性,為了減少能耗,選取7 h為乳酸菌發(fā)酵提取的最佳時間。

圖1 提取時間對ODP得率的影響Fig.1 Effect of time on the ODP yield注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),相同字母表示差異不顯著(p>0.05),圖2～圖6同。

2.1.2 液料比對得率的影響 按照方法1.2.3.2 探究不同液料比對ODP提取的影響,結(jié)果見圖2,隨著液料比的增加,ODP得率顯著性增加(p<0.05),當(dāng)液料比為20∶1 mL/g增加為25∶1 mL/g時,得率不顯著增加達(dá)到最大值0.23%(p>0.05),隨后得率顯著性下降(p<0.05)。這是因為在一定范圍內(nèi),增加提取液體積可以增加溶劑與提取物質(zhì)的接觸面積,使多糖得以較多溶出,但繼續(xù)增加提取液體積會使多糖達(dá)到飽和[20]。因此,乳酸菌發(fā)酵提取的最佳提取液料比為25∶1 mL/g。

圖2 提取液料比對ODP得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio on the ODP yield

2.1.3 pH對得率的影響 按照方法1.2.3.3探究不同pH對ODP提取的影響,結(jié)果見圖3,隨著pH升高,ODP得率顯著增加(p<0.05),在pH=5時得率達(dá)到了最大值0.28%,pH在5～6時得率不顯著降低(p>0.05),超過6之后,得率顯著降低(p<0.05)。這是因為乳酸菌適宜在弱酸情況下生長,隨著pH的降低,菌體生長受到抑制[21]。因此,選取5作為乳酸菌發(fā)酵提取的最佳pH。

圖3 提取pH對ODP得率的影響Fig.3 Effect of pH on the ODP yield

以溫度為35 ℃,時間為7 h,pH為5,液料比為25∶1 mL/g為試驗條件,提取ODP,所得的ODP得率為0.26%。經(jīng)過工藝優(yōu)化的熱水浸提法得到的得率最高為0.12%[22],乳酸菌發(fā)酵的ODP得率比熱水浸提法的得率高出0.14%。

2.2 酵母提取多糖的單因素實驗

2.2.1 時間對得率的影響 按照方法1.2.4.1探究不同發(fā)酵時間對ODP提取的影響,結(jié)果見圖4,在24～48 h這段時間內(nèi),隨著時間的增加,得率顯著性增加(p<0.05),48 h時得率最大為0.51%,而后得率變化不顯著(p>0.05)。這是由于提取時間短時,ODP溶出不完全,黃酒酵母生長還處于遲緩期或?qū)?shù)期,而提取時間長黃酒酵母會隨著時間的增長而逐漸衰亡,從而失去活性,為了減少能耗,選取為48 h為黃酒酵母發(fā)酵提取的最佳時間。

圖4 提取時間對ODP得率的影響Fig.4 Effect of time on the ODP yield

2.2.2 液料比對得率的影響 按照方法1.2.4.2探究不同液料比對ODP提取的影響,結(jié)果見圖5,隨著液料比的增加,ODP得率發(fā)生顯著性變化,當(dāng)液料比達(dá)到20∶1 mL/g，ODP出現(xiàn)降低，當(dāng)液料比達(dá)到25∶1 mL/g,得率升高到最大為0.48%,隨后得率顯著下降(p<0.05)。這是因為在一定范圍內(nèi),隨著液料比的增大，提取液體積變大，提取的損耗增加，在液料比20∶1 mL/g時損耗增大量大于提取率的增大量，當(dāng)提取液體積繼續(xù)增大時，損耗比提取得率的增加量小，但當(dāng)達(dá)到某一提取液體積時，多糖溶出會達(dá)到飽和從而使ODP得率下降。因此,取25∶1 mL/g為黃酒酵母發(fā)酵提取最佳液料比。

圖5 料液比對ODP得率的影響Fig.5 Effect of liquid-to-material ratio on the ODP yield

2.2.3 pH對得率的影響 按照方法1.2.4.3探究不同pH對ODP提取的影響,結(jié)果見圖6,在pH=3時ODP得率最高0.53%,隨著pH的增加得率顯著降低(p<0.05)。黃酒酵母適應(yīng)偏酸性環(huán)境,但不適應(yīng)強酸。因此,黃酒酵母發(fā)酵提取最佳pH為3。

圖6 提取pH對ODP得率的影響Fig.6 Effect of pH on the ODP yield

經(jīng)過工藝優(yōu)化的熱水浸提法得到的得率最高為0.12%[22],經(jīng)本實驗所得的黃酒酵母發(fā)酵的工藝條件為溫度28 ℃，時間48 h，液料比25∶1 mL/g，pH為3，得率能達(dá)到0.53%,比熱水浸提法得率到了4倍。

2.3 MTT法測定Hacat細(xì)胞毒性

如圖7所示,以未加任何ODP的細(xì)胞作空白對照,當(dāng)ODP濃度高達(dá)2 mg/mL時,細(xì)胞增殖活力依然超過90%,說明ODP對細(xì)胞幾乎無毒性。且當(dāng)ODP濃度減小,細(xì)胞增殖活力反而增加,ODP濃度為0.5 mg/mL時,細(xì)胞存活率高達(dá)109.07%,說明低濃度ODP對HacaT有增殖作用。

圖7 ODP濃度對Hacat細(xì)胞存活率的影響Fig.7 Cell viability with different polysaccharide of Opuntia dillenii(Ker-Gawl.)Haw

2.4 ODP處理時間對炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8基因表達(dá)的影響

考察時間效應(yīng),用ODP處理Hacat細(xì)胞,2 h內(nèi)炎癥因子類基因(IL-6、IL-8)表達(dá)量產(chǎn)生了不同的變化。

促炎癥因子IL-6是一種在炎癥和免疫反應(yīng)中具有多種功能細(xì)胞因子,可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)中花生四烯酸的釋放,刺激T細(xì)胞活化和增殖,提高B細(xì)胞中免疫球蛋白的生成,并且誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白的產(chǎn)生[23]。ODP添加時間對促炎癥因子IL-6表達(dá)量的影響如圖8所示,可看出15 min內(nèi)基因表達(dá)量出現(xiàn)降低,15～30 min時間內(nèi)IL-6表達(dá)量平緩升高,而在30～90 min時間內(nèi),表達(dá)量發(fā)生了顯著的提高(p<0.01),此后又緩慢下降,在2 h的表達(dá)量與60 min時的表達(dá)量差不多,但是顯著高于初始值(p>0.05)。整體來看,30 min后的促進(jìn)作用是ODP對IL-6基因表達(dá)量的主要影響。ODP對IL-6基因表達(dá)量的影響作用,可驗證ODP可能是通過促進(jìn)IL-6基因的表達(dá)從而影響花生四烯酸的代謝而起到抗炎作用的。

圖8 ODP處理不同時間對IL-6表達(dá)量影響Fig.8 Influence of treatment time by ODP on IL-6 expression注:*:與初始值(作用時間為0 min)相比,差異顯著(p<0.05);**:與初始值相比,差異極顯著(p<0.01)；圖9同。

IL-8在許多炎癥反應(yīng)中具有聚集和激活淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能,可因局部產(chǎn)生的IL-8直接作用于表皮細(xì)胞,促進(jìn)慢性炎癥的發(fā)展[24]。ODP添加時間對的其表達(dá)量的影響如圖9所示,IL-8基因的表達(dá)量在15 min內(nèi)迅速下降,顯著低于初始值(p<0.01),并在之后的15 min內(nèi)繼續(xù)緩慢下降,在30～90 min這段時間內(nèi)在保持顯著小于初始值的范圍內(nèi)緩慢上升(p<0.05),而之后到2 h之間,其又緩慢下降。整體來看,在0～15 min內(nèi)ODP迅速抑制IL-8的表達(dá),并在2 h的時間內(nèi)ODP始終保持抑制IL-8的表達(dá),這是ODP對IL-8基因作用的主要體現(xiàn)。大量的中性粒細(xì)胞因IL-8表達(dá)的增高而向炎癥區(qū)域聚集,從而釋放炎癥介質(zhì)加重炎癥反應(yīng)。IL-8的表達(dá)因受到ODP作用而受到抑制,間接地炎癥的發(fā)生和發(fā)展就受到抑制。

圖9 ODP處理不同時間對IL-8表達(dá)量影響Fig.9 Influence of different training time by ODP on IL-8 expression

3 結(jié)論

在本課題的研究中,采用乳酸菌與黃酒酵母對用微生物法提取多糖進(jìn)行了初步探索。結(jié)果顯示,同樣直接使用新鮮的仙人掌汁進(jìn)行提取,采用乳酸菌發(fā)酵最適提取工藝:發(fā)酵時間7 h、液料比25∶1 (mL/g)、pH為5,此工藝下多糖得率為0.26%。黃酒酵母發(fā)酵最適提取工藝:發(fā)酵時間48 h、液料比25∶1 (mL/g)、pH為3,此工藝下多糖得率為0.53%,黃酒酵母發(fā)酵所得ODP得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乳酸菌,因此選取黃酒酵母作為發(fā)酵菌種提取ODP會更有優(yōu)勢。本課題也探究了ODP抗炎能力,結(jié)果顯示ODP通過抑制IL-8的表達(dá),促進(jìn)IL-6的表達(dá)來抑制炎癥的發(fā)生和發(fā)展,為研究仙人掌的抗炎效果提供理論依據(jù)。