,,,, , ,,,*

(1.福建省水產(chǎn)研究所,福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361013; 2.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,福建廈門(mén) 361013; 3.華僑大學(xué)生物化工學(xué)院,福建廈門(mén) 361021; 4.寧德師范學(xué)院生物系,福建寧德 352100)

抗氧化多肽具有減緩或防止生物大分子過(guò)氧化以及清除體內(nèi)自由基的功效,其活性與特定氨基酸組成、序列排布和空間構(gòu)象密切相關(guān)[6-7]。利用蛋白酶水解有利于大分子蛋白質(zhì)中抗氧化氨基酸的暴露,同時(shí)蛋白來(lái)源、蛋白酶類(lèi)型、水解程度和預(yù)處理工藝等因素亦決定了酶解多肽的抗氧化活性[8-9]。研究發(fā)現(xiàn),海參體壁酶解多肽具有顯著的體外抗氧化活性[10-12],然而目前尚未有對(duì)養(yǎng)殖刺參,特別是南方新興規(guī)模化養(yǎng)殖刺參的酶解多肽工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究。

因此,本研究以福建養(yǎng)殖仿刺參(Apostichopusjaponicus)體壁為原料,選擇水解度、體外DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo),從6種蛋白酶中篩選出制備仿刺參抗氧化多肽的最適蛋白水解酶;以單因素法、Box Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化酶解工藝;測(cè)定仿刺參酶解多肽的體外抗氧化活性;進(jìn)一步探討仿刺參抗氧化多肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)效應(yīng),以期為仿刺參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值開(kāi)發(fā)與商業(yè)增值轉(zhuǎn)化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

仿刺參(Apostichopusjaponicus) 重量在200～300 g之間,福建省寧德市霞浦縣利豐達(dá)水產(chǎn)有限公司;DMEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清、杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBS)、青-鏈霉素、胰酶細(xì)胞消化液 美國(guó)Hyclone公司;DMSO、MTS、HAT培養(yǎng)基添加劑 美國(guó)Sigma公司;中性蛋白酶(5萬(wàn)U/g)、堿性蛋白酶(5萬(wàn)U/g)、風(fēng)味蛋白酶(2萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(8萬(wàn)U/g)、動(dòng)物蛋白水解酶(10萬(wàn)U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;胃蛋白酶(1200 U/g) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他化學(xué)試劑(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;色譜柱OHpak SB-802.5HQ(8.0 mm×300 mm,6 μm) 日本昭和電工集團(tuán);人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926 用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素、2% HAT添加劑的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度條件下培養(yǎng),細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底70%～80%時(shí),用1 mL胰酶細(xì)胞消化液消化1 min左右,按1∶3傳代培養(yǎng) 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒(FRAP法)微板法、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒(比色法)、羥自由基測(cè)試試劑盒、細(xì)胞丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(微板法)、總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(WST-1 法) 南京建成生物工程研究所;研磨玻璃珠 德國(guó)Qiagen公司。

臺(tái)式多功能切肉機(jī)TJ-85 廣東樂(lè)創(chuàng)電器有限公司;恒溫水浴鍋HH-6 常州國(guó)華電器有限公司;臺(tái)式離心機(jī)5810R 德國(guó)Eppendorf公司;凝膠色譜儀ELEOS System 美國(guó)Wyatt公司;生物安全柜AC2-4S1 新加坡ESCO公司;CO2培養(yǎng)箱Galaxy 170S 德國(guó)Eppendorf公司;倒置顯微鏡和照相系統(tǒng)DMi8 德國(guó)Leica公司;酶標(biāo)儀InfiniteM200 瑞士TECAN公司;組織破碎儀TissueLyser II 德國(guó)Qiagen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 仿刺參的預(yù)處理 新鮮仿刺參去泥、去除內(nèi)臟,蒸餾水洗凈體壁,過(guò)水煮沸5 min,濾紙瀝干表體水分后切塊,絞肉機(jī)攪碎,真空包裝,實(shí)驗(yàn)前-20 ℃保存。

1.2.2 最適酶類(lèi)型的選擇 酶解前,將真空包裝原料置流水至解凍。在固定料液比1∶20 g/mL和加酶量5000 U/g底物條件下,選擇各蛋白酶說(shuō)明書(shū)最適酶解溫度、pH進(jìn)行酶解(中性蛋白酶:50 ℃、pH7.5;胃蛋白酶:40 ℃、pH2;堿性蛋白酶:50 ℃、pH8;風(fēng)味蛋白酶:50 ℃、pH7;木瓜蛋白酶:50 ℃、pH7;動(dòng)物蛋白水解酶:50 ℃、pH7.5),在酶解20、40、60、120、180、240、300、360 min時(shí)移取酶解液,酶解完成后,將酶解液放置于100 ℃水浴鍋中,滅酶10 min。10000 r/min離心10 min,取上清液分別測(cè)定各酶解液的水解度、體外DPPH自由基清除率,選取酶解6 h酶解液,測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量分布情況,綜合評(píng)價(jià)篩選出最適用蛋白酶。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 水解度的測(cè)定 水解度的測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]操作,采用比色法測(cè)定游離氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度[14],采用微量凱氏定氮法測(cè)定總氮質(zhì)量[15],按照公式(1)計(jì)算。

式(1)

式(1)中:N2為仿刺參蛋白酶解后溶液中游離總氨基態(tài)氮質(zhì)量(g);N1為仿刺參蛋白酶解前溶液中游離總氨基態(tài)氮質(zhì)量(g);N0為仿刺參蛋白中總氮質(zhì)量(g)。

1.2.3.2 體外DPPH自由基清除率測(cè)定 體外DPPH自由基清除率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]操作,按照公式(2)計(jì)算:

式(2)

1.2.3.3 相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定 移取樣品溶于流動(dòng)相中,用流動(dòng)相定容至50 mL,經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾后,進(jìn)樣20 μL,樣品流經(jīng)凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化,再流經(jīng)激光檢測(cè)器(LS)和示差檢測(cè)器(DRI)中進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)樣條件:色譜柱OHpak SB-802.5HQ(8.0 mm×300 mm,6 μm);流速0.500 mL/min;流動(dòng)相NaNO3(0.2 mol/L的硝酸鈉溶液過(guò)0.22微米孔徑濾膜并超聲波脫氣15 min);柱溫25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 加酶量對(duì)酶解效果的影響 根據(jù)酶類(lèi)型篩選結(jié)果,選用動(dòng)物蛋白水解酶在料液比(1∶20)、酶解2 h、酶解溫度50 ℃、pH7.5條件下,探討加酶量(1000、3000、5000、7000、9000、11000、13000 U/g)對(duì)酶解產(chǎn)物的水解度體外清除DPPH自由基能力的影響。

1.2.4.2 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響 選用動(dòng)物蛋白水解酶在料液比(1∶20)、酶解2 h、加酶量5000 U/g、pH7.5條件下,探討酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)酶解產(chǎn)物的水解度與體外清除DPPH自由基能力的影響。

1.2.4.3 pH對(duì)酶解效果的影響 選用動(dòng)物蛋白水解酶在料液比(1∶20)、酶解2 h、加酶量5000 U/g、溫度50 ℃條件下,探討pH(5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)對(duì)酶解產(chǎn)物的水解度與體外清除DPPH自由基能力的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 使用Design Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),以溫度(A)、加酶量(B)和pH(C)為自變量,以體外清除DPPH自由基率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn),確定酶解工藝最佳條件。實(shí)驗(yàn)因素及其水平的取值見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table for respond surface methodology

1.2.6 酶解多肽體外抗氧化活性的測(cè)定 根據(jù)1.2.5響應(yīng)面法獲得的酶解優(yōu)化工藝制備仿刺參多肽,滅酶后10000 r/min離心10 min,取上清液凍干,獲得仿刺參體壁酶解多肽(Apostichopusjaponicusbody wall enzymolysis polypeptide,AJEP)凍干粉。采用DPPH法、Fenton法、黃嘌呤法、FRAP法,分別按照文獻(xiàn)[10]、羥自由基測(cè)試試劑盒、超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,按照公式(3～6)計(jì)算仿刺參酶解多肽的體外抗氧化活性。

DPPH自由基清除率(%)

式(3)

式(4)

超氧陰離子自由基清除率(%)

式(5)

式(6)

1.2.7 H2O2氧化應(yīng)激損傷EA.hy926細(xì)胞模型的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA hy.926細(xì)胞,以2.5×104/mL細(xì)胞數(shù)接種于96孔板,每孔200 μL,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)16～24 h貼壁后,棄原培養(yǎng)基,按梯度加入用DMEM培養(yǎng)基配制的H2O2溶液(50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900 μmol/L),設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)4 h后,小心吸去孔內(nèi)液體,加入100 μL MTS應(yīng)用液,培養(yǎng)2 h后,用酶標(biāo)儀(490 nm)測(cè)定各孔吸光值。按照公式(7)計(jì)算細(xì)胞抑制率,使用Graphpad prism 6.0軟件非線(xiàn)性回歸分析,計(jì)算獲得H2O2誘導(dǎo)EA.hy926氧化應(yīng)激產(chǎn)生50%損傷的半抑制濃度IC50。

式(7)

1.2.8 抗氧化多肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 稱(chēng)取一定量AJEP,使用DMEM培養(yǎng)基配制成不同濃度梯度的酶解多肽(低劑量組:0.05 mg/mL、中劑量組:0.5 mg/mL、高劑量組:5 mg/mL)。采用1.2.7方法,接種細(xì)胞貼壁后,棄原培養(yǎng)基,按梯度加入樣品組,設(shè)空白對(duì)照組、H2O2組。不同組處理情況為:空白對(duì)照組:原DMEM培養(yǎng)基;樣品組:低劑量組:0.05 mg/mL AJEP,中劑量組:0.5 mg/mL AJEP,高劑量組:5 mg/mL AJEP;H2O2組:0.05 mg/mL AJEP+200 μmol/L H2O2,0.5 mg/mL AJEP+200 μmol/L H2O2,5 mg/mL AJEP+200 μmol/L H2O2。預(yù)處理24 h后,加入用DMEM培養(yǎng)基配制的H2O2(半數(shù)抑制濃度)處理4 h,小心吸去孔內(nèi)液體,加入100 μL MTS應(yīng)用液,培養(yǎng)2 h后,檢測(cè)各孔吸光值。按照公式(8)計(jì)算細(xì)胞存活率。

式(8)

1.2.9 細(xì)胞氧化及抗氧化水平測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA hy.926細(xì)胞,以2.5×104/mL細(xì)胞數(shù)接種于60 mm培養(yǎng)皿,每皿4 mL,分組及處理如1.2.8所述,終止培養(yǎng)后,棄原培養(yǎng)基后用D-PBS清洗2次,用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞,D-PBS清洗2次,離心、棄上清,4 ℃進(jìn)行細(xì)胞破碎,離心、取上清液,分別按照細(xì)胞丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,按照公式(9～10)計(jì)算MDA和SOD含量。

式(9)

式(10)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 最適蛋白酶類(lèi)型的篩選

采用中性蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶等6種酶在相同的初始底物濃度、酶濃度、各自適合的酶解溫度、pH條件下對(duì)仿刺參體壁進(jìn)行酶解,水解度、體外DPPH自由基清除率結(jié)果見(jiàn)圖1～圖2,選取6 h酶解液測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量分布情況,結(jié)果見(jiàn)表2。不同酶的活性部位和底物特異性不同,水解能力存在差異。由圖1可知,隨著時(shí)間增加,動(dòng)物蛋白水解酶、風(fēng)味蛋白酶酶解液水解度逐漸大于其余酶類(lèi)型,說(shuō)明這兩種酶與仿刺參可酶解肽鍵結(jié)合能力較好,具有較強(qiáng)的水解仿刺參蛋白的能力。酶解初始,仿刺參表面可溶性蛋白較易擴(kuò)散到溶液中與酶接觸,肽鍵不斷水解,游離氨基酸、寡肽含量增多,水解度迅速增大;隨著反應(yīng)進(jìn)行,可酶解肽鍵濃度下降,產(chǎn)物濃度增加對(duì)酶解反應(yīng)起反饋抑制作用,水解速率趨緩,水解度趨于平衡。由圖1可知,6種酶酶解液水解速率均在初始60 min內(nèi)增速較快,之后隨時(shí)間延長(zhǎng)、水解度增加而減緩,在反應(yīng)進(jìn)行240 min之后,水解度趨于穩(wěn)定。

圖1 仿刺參酶解過(guò)程中不同種類(lèi)酶酶解產(chǎn)物水解度的變化Fig.1 Change of hydrolysis degree of hydrolysates of Apostichopus japonicus by different enzymes during enzymolysis

不同蛋白酶與底物的作用位點(diǎn)不同,酶解產(chǎn)物的肽鏈結(jié)構(gòu)不同,功能活性亦不同。由圖2可知,在考察時(shí)間內(nèi)中性蛋白酶和動(dòng)物蛋白水解酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除活性均大于其余酶類(lèi)型,說(shuō)明中性蛋白酶和動(dòng)物蛋白水解酶對(duì)仿刺參蛋白具有較好的抗氧化活性酶切位點(diǎn)與特異性。6種蛋白酶的酶解產(chǎn)物體外DPPH自由基清除率均隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在最初的60 min內(nèi)迅速增加,后隨時(shí)間延長(zhǎng)而增速變緩,于酶解120 min后趨于平穩(wěn)。

圖2 仿刺參酶解過(guò)程中不同種類(lèi)酶酶解產(chǎn)物體外DPPH自由基清除率的變化Fig.2 Change of DPPH free radical scavenging abilities in vitro of hydrolysates of Apostichopus japonicusby different enzymes during enzymolysis

酶解產(chǎn)物的功能活性與其氨基酸組成有直接關(guān)系,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),特定功能活性肽多是小分子多肽[16]。由表2可知,不同蛋白酶酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布存在差異,風(fēng)味蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶酶解產(chǎn)物中相對(duì)分子質(zhì)量小于1000 Da的組分占比明顯高于其余4種酶解物,含量分別為95.64%和90.13%,說(shuō)明風(fēng)味蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶酶解產(chǎn)物中2～6個(gè)氨基酸組成的小分子多肽比例較高,這兩種酶有較好的水解仿刺參蛋白制備小分子多肽或氨基酸的能力。風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物中100～300 Da組分含量最高,占比為62.78%,說(shuō)明風(fēng)味蛋白酶酶解物中游離氨基酸、二肽較多;動(dòng)物蛋白水解酶酶解產(chǎn)物中300～600 Da組分占比最高,占比為45.81%,說(shuō)明動(dòng)物蛋白水解酶酶解物中小分子短肽較多。

表2 仿刺參酶解過(guò)程不同酶解產(chǎn)物分子量分布Table 2 Relative molecular weight distribution of different enzymatic hydrolysates of Apostichopus japonicus

綜上可知,與其余5種蛋白酶相比,動(dòng)物蛋白水解酶能較好地水解仿刺參體壁,酶解120 min時(shí),其產(chǎn)物的體外DPPH自由基清除活性較高且趨于穩(wěn)定,其中相對(duì)分子質(zhì)量小于1000 Da的小分子多肽含量達(dá)90.13%,因此,選擇動(dòng)物蛋白水解酶作為最適蛋白酶,進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度對(duì)酶解效果的影響 由圖3可知,在30～70 ℃范圍內(nèi),酶解產(chǎn)物的水解度和體外DPPH自由基清除率隨著溫度的遞增呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度在30～50 ℃時(shí),水解度和清除率隨著溫度遞增而迅速增加;當(dāng)溫度在50～70 ℃時(shí),水解度和清除率隨著溫度遞增而迅速遞減。溫度對(duì)酶活力具有激活效應(yīng)和失活效應(yīng),當(dāng)溫度低于最適溫度時(shí),隨著溫度升高,酶促反應(yīng)加快;當(dāng)溫度高于最適溫度,酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,酶活喪失,反應(yīng)速度下降?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)成本等因素,最適溫度選擇50 ℃。

圖3 溫度對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和體外DPPH自由基清除率的影響 Fig.3 Effects of temperatures on the hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate of the enzymatic hydrolysates in vitro

2.2.2 加酶量對(duì)酶解效果的影響 由圖4可知,酶解產(chǎn)物的水解度和體外DPPH自由基清除率隨著加酶量的增加而增加。當(dāng)加酶量在1000～7000 U/g時(shí),水解度和清除率隨著加酶量的增加而迅速增加;當(dāng)加酶量在7000～13000 U/g時(shí),水解度和DPPH自由基清除率增速漸緩,趨于極限?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)成本等因素,最適加酶量選擇7000 U/g。

圖4 加酶量對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和體外DPPH自由基清除率的影響 Fig.4 Effects of enzyme dosage on the hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate of the enzymatic hydrolysates in vitro

2.2.3 pH對(duì)酶解效果的影響 由圖5可知,酶解產(chǎn)物的水解度和體外DPPH自由基清除率隨著pH的遞增呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)pH在5.5～7.5時(shí),水解度和體外DPPH自由基隨著pH的增加而增加;當(dāng)pH在7.5～9.5時(shí),水解度和體外DPPH自由基隨著pH的增加而減少。pH是酶促反應(yīng)的重要影響因素,過(guò)高或過(guò)低將使酶活性結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化,同時(shí)改變底物解離程度,進(jìn)而影響酶與底物結(jié)合,使酶解效率下降。因此,選擇最適pH為7.5。

圖5 pH對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和體外DPPH自由基清除率的影響 Fig.5 Effect of pH on the hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate of the enzymatic hydrolysates in vitro

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面模型的建立和顯著性檢驗(yàn) 以溫度(A)、加酶量(B)和pH(C)為試驗(yàn)因素,以體外DPPH自由基清除率為響應(yīng)值,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析見(jiàn)表3。

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表3進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到DPPH清除率對(duì)溫度、加酶量和pH的二次多項(xiàng)回歸方程:

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

R1=68.25+0.90A+0.31B+0.16C+2.500E-0.05AB-0.13AC-0.082BC-3.29A2-0.62B2-1.63C2。

回歸模型方差分析(表4)表明,建立的回歸模型p值(0.0018)<0.01,極顯著;失擬項(xiàng)p值(0.9375)>0.05,不顯著,表明模型和試驗(yàn)值擬合度良好。通過(guò)對(duì)p值的檢驗(yàn)可見(jiàn),對(duì)結(jié)果的影響大小為A>B>C,即溫度>加酶量>pH,二次項(xiàng)A2、C2對(duì)響應(yīng)值DPPH清除率的影響極顯著(p<0.01),一次項(xiàng)A對(duì)響應(yīng)值DPPH清除率的影響顯著(p<0.05),其余項(xiàng)影響不顯著(p>0.05),說(shuō)明響應(yīng)面主效應(yīng)顯著,各因素之間交互作用較小。模型R2為0.9385,調(diào)整后R2為0.8595,Rsn2=9.816,說(shuō)明該模型具有較好的預(yù)測(cè)作用。由上述分析可知,該模型很好地反映了DPPH清除率和酶解溫度、加酶量、pH之間的關(guān)系,可以使用此模型對(duì)動(dòng)物蛋白水解酶制備仿刺參抗氧化多肽的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化分析和預(yù)測(cè)。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析 等高線(xiàn)圖和3D響應(yīng)面可以直觀地展現(xiàn)酶解溫度、加酶量、pH之間的交互關(guān)系。從圖6中各個(gè)等高線(xiàn)可直觀發(fā)現(xiàn),溫度的變化對(duì)DPPH清除率的影響明顯高于加酶量。溫度和pH的等高線(xiàn)形狀趨于圓形,表明其交互作用較弱,而pH的變化對(duì)DPPH清除率的影響明顯高于加酶量。

圖6 兩因素之間的交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of two factors intercction on DPPH radical scavenging rate

通過(guò)Design Expert 8.0軟件對(duì)回歸方程的分析,得到各因素最佳條件為:溫度50.68 ℃、加酶量7123.19 U/g、pH7.52,此模型下,響應(yīng)值為68.35?？紤]到實(shí)際情況,結(jié)合表3進(jìn)行調(diào)整后的最佳條件為:溫度50 ℃、加酶量7000 U/g、pH7.5。

2.3.3 最優(yōu)條件的確定和驗(yàn)證 為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性,以酶解溫度50 ℃、加酶量7000 U/g、pH7.5,反復(fù)試驗(yàn)3次,得到響應(yīng)值為68.81%,與模型預(yù)測(cè)值68.35%相對(duì)誤差為1%,表明回歸模型可以很好地預(yù)測(cè)動(dòng)物蛋白水解酶制備仿刺參多肽的酶解工藝參數(shù)。

2.4 仿刺參酶解多肽的體外抗氧化活性

圖7 仿刺參體壁酶解多肽的體外抗氧化活性 Fig.7 Antioxidant activities of enzymolysis polypeptide of A.japonicus in vitro

2.5 仿刺參抗氧化多肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926損傷的保護(hù)作用

2.5.1 H2O2對(duì)EA.hy926細(xì)胞活性的影響 采用0～900 μmol/L的H2O2構(gòu)建EA.hy926氧化應(yīng)激模型,以細(xì)胞抑制率作為細(xì)胞損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果由圖8可知,H2O2濃度在0～150 μmol/L時(shí),隨著劑量的升高,其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力抑制作用增強(qiáng),H2O2對(duì)細(xì)胞損傷相對(duì)緩和;濃度在150～900 μmol/L時(shí),細(xì)胞抑制率快速升高,呈現(xiàn)顯著劑量-效應(yīng)關(guān)系,H2O2對(duì)細(xì)胞損傷及反應(yīng)更加強(qiáng)烈。若細(xì)胞抑制率過(guò)高,說(shuō)明細(xì)胞損傷嚴(yán)重、難以逆轉(zhuǎn),若細(xì)胞抑制率過(guò)低,說(shuō)明細(xì)胞損傷不夠,均不利于開(kāi)展損傷保護(hù)研究,因此選擇對(duì)細(xì)胞造成半數(shù)抑制率的濃度作為造模理想濃度。根據(jù)Graphpad軟件計(jì)算獲得H2O2的半數(shù)抑制濃度(IC50)值約為185.90 μmol/L,考慮到實(shí)際操作情況,選取200 μmol/L H2O2濃度建立損傷模型。

圖8 過(guò)氧化氫(H2O2)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926活性的影響(n=3)Fig.8 Effect of different concentrations of H2O2 on EA.hy926(n=3)注:a表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05),b表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)。

2.5.2 抗氧化多肽對(duì)EA.hy926細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用 由表5可知,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926中加入不同劑量濃度的仿刺參多肽AJEP,培養(yǎng)24 h后,與空白對(duì)照組相比,低、中、高劑量組細(xì)胞存活率均在90%以上,說(shuō)明AJEP對(duì)EA.hy926細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用。而后選擇200 μmol/L H2O2處理4 h,與空白對(duì)照組比較,H2O2組細(xì)胞存活率差異極顯著(p<0.01),為42.75%±1.27%,說(shuō)明氧化應(yīng)激損傷模型成功可靠。以低、中、高劑量AJEP處理EA.hy926細(xì)胞24 h后,200 μmol/L H2O2處理4 h后,與H2O2組相比,在0.05～5 mg/mL 濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,AJEP對(duì)EA.hy926細(xì)胞的保護(hù)率明顯增加,死亡數(shù)量下降,中、高劑量組細(xì)胞存活率分別為57.33%±4.27%(p<0.05)和85.56%±2.23%(p<0.01),均在50%以上,說(shuō)明中、高濃度仿刺參抗氧化多肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有顯著保護(hù)效應(yīng)。

表5 仿刺參抗氧化多肽對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用(n=3)Table 5 Effect of enzymolysis polypeptide of A.japonicuson EA.hy926 cells viability injured by H2O2(n=3)

2.5.3 抗氧化多肽對(duì)EA.hy926細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷MDA含量、SOD活性的影響 以MDA含量和SOD活性作為EA.hy926細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的氧化和抗氧化檢測(cè)指標(biāo)。由表6可知,與空白對(duì)照組比較,H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷EA.hy926細(xì)胞中MDA含量顯著升高(p<0.05),SOD活性極顯著降低(p<0.01);而經(jīng)過(guò)仿刺參酶解抗氧化多肽預(yù)處理的EA.hy926細(xì)胞中,隨著AJEP濃度提高,MDA含量降低,SOD活性增強(qiáng),呈劑量-效應(yīng)關(guān)系;與H2O2損傷組比較,中劑量AJEP組SOD活性極顯著升高(p<0.01),而MDA含量差異不顯著(p>0.05),高劑量AJEP組MDA含量顯著降低、SOD活性顯著升高(p<0.05)。

表6 仿刺參抗氧化多肽對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的MDA、SOD的影響(n=3)Table 6 Effect of enzymolysis polypeptide ofA.japonicus on MDA and SOD expression in EA.hy926 cells injured by H2O2(n=3)

3 結(jié)論