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(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

乳酸的首次發(fā)現(xiàn)可以追溯到1780年,它被Scheele在酸乳中發(fā)現(xiàn)[1]。乳酸在發(fā)酵和人類(lèi)食品方面的應(yīng)用有著悠久的歷史[2]。乳酸是一種多用途天然有機(jī)酸,現(xiàn)今還應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和化工等領(lǐng)域[3]。乳酸的分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,但含有不對(duì)稱(chēng)碳源,有兩種光學(xué)異構(gòu)體:L(+)-乳酸和D(-)-乳酸[3]。乳酸已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)列為安全的(GRAS)食品添加劑,但D(-)-乳酸對(duì)人體代謝是有害的,可能導(dǎo)致酸中毒和脫鈣作用[4]。

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)具有較高的乳酸生產(chǎn)能力[5],屬于革蘭氏陽(yáng)性菌,細(xì)胞壁硬(或厚),細(xì)胞呈桿狀,細(xì)胞兩端產(chǎn)芽孢,無(wú)鞭毛[6]。凝結(jié)芽孢桿菌的生長(zhǎng)溫度為45～60 ℃,是一種嗜熱菌,耐酸能力極強(qiáng),可在pH小于2.4的培養(yǎng)液中存活一年,最適pH在4.5～6.5之間[7]。凝結(jié)芽孢桿菌最早是在變質(zhì)的牛奶中發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)[8],后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其可以利用各種糖類(lèi)轉(zhuǎn)化成乳酸,并且具有耐高溫、耐酸,糖酸轉(zhuǎn)化率高和產(chǎn)乳酸光學(xué)純度好等特點(diǎn)。凝結(jié)芽孢桿菌有很好的發(fā)酵特性,其在50～55 ℃的發(fā)酵條件下進(jìn)行分批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的過(guò)程可以不用滅菌操作。Qin等[9]在50 ℃培養(yǎng)條件下，不經(jīng)過(guò)滅菌利用凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵,獲得了光學(xué)純度99%以上的L-乳酸。凝結(jié)芽孢桿菌雖然具有很高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值,但當(dāng)前工業(yè)上對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的應(yīng)用還不是很多,其良好的生物學(xué)特性尚未得到充分利用,其原因之一就是對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌乳酸發(fā)酵相關(guān)基因的了解還很少[10]。

凝結(jié)芽孢桿菌乳酸代謝過(guò)程是葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解途徑(EMP)，再經(jīng)過(guò)乳酸脫氫酶催化后生成乳酸[11-12],在凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050菌種中存在三種乳酸脫氫基因:ldhL1、ldhL2和ldhD,即L型乳酸生成相關(guān)的L-乳酸脫氫酶基因兩個(gè),D型乳酸生成相關(guān)的D-乳酸脫氫酶基因一個(gè)。本文對(duì)5株凝結(jié)芽孢桿菌的乳酸發(fā)酵特性進(jìn)行了研究,并以ATCC7050為例，研究了3個(gè)乳酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄與乳酸合成的關(guān)系,對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌代謝研究和基因改造奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)ATCC7050、凝結(jié)芽孢桿菌36D1、凝結(jié)芽孢桿菌P4-102B、凝結(jié)芽孢桿菌HL5、凝結(jié)芽孢桿菌HL5-C 均由本實(shí)驗(yàn)室保藏;葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏 凌峰化學(xué)試劑有限公司(上海);L/D-LACTATE試劑盒 Megazyme公司;葡萄糖試劑盒 科欣生物技術(shù)(上海)研究所;RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、SYBR Premix Dimer Eraser、細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

SBA-40E型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;ZWY-211C型恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)柜 智城分析儀器制造有限公司(上海);UV-2102PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 菁華科技儀器有限公司(上海);FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利儀器;96孔實(shí)時(shí)定量PCR儀CFX connect 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 LB培養(yǎng)基(g/L)[13],固體培養(yǎng)基再加入2%的瓊脂,pH調(diào)節(jié)為5.0,用于凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)。

茄子瓶斜面培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉浸膏6 g/L,酵母提取物10 g/L,檸檬酸二胺2 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,乙酸鈉4 g/L,硫酸鎂0.2 g/L,硫酸錳0.2 g/L,瓊脂18 g/L,吐溫-80 1 mL,碳酸鈣10 g/L,NaOH調(diào)pH至6.0。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母膏10 g/L,檸檬酸二胺2 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,硫酸鎂0.2 g/L,硫酸錳0.2 g/L,氯化鈉0.03 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L,乙酸鈉4 g/L,吐溫-80 1 mL,碳酸鈣25 g/L,NaOH調(diào)pH至6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖90 g/L,蛋白胨13.33 g/L,酵母膏13.33 g/L,硫酸鎂0.0133 g/L,硫酸錳0.0133 g/L,氯化鈉0.0133 g/L,硫酸亞鐵0.0133 g/L,乙酸鈉0.67 g/L,碳酸鈣40 g/L,NaOH調(diào)pH至6.0。

1.2.2 凝結(jié)芽孢桿菌乳酸發(fā)酵培養(yǎng) 取100 μL甘油管中的凝結(jié)芽孢桿菌(ATCC7050、36D1、HL5、HL5-C和P4-102B)菌液，均勻涂布于茄子瓶斜面培養(yǎng)基中,50 ℃,12 h,連續(xù)培養(yǎng)兩代進(jìn)行活化,用50 mL滅菌水將活化菌株從茄子瓶斜面培養(yǎng)基中洗脫下來(lái)，之后接入(按15% v/v接種量)種子搖瓶培養(yǎng)基中,搖床(50 ℃,100 r/min)振蕩培養(yǎng)12 h后再接入(按15% v/v接種量)發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中,搖床(50 ℃,200 r/min)振蕩培養(yǎng)48 h 。

1.2.3 五種凝結(jié)芽孢桿菌乳酸發(fā)酵48 h指標(biāo)的測(cè)定

1.2.3.1 L-乳酸和D-乳酸的測(cè)定 根據(jù)1.2.2方法對(duì)五種凝結(jié)芽孢桿發(fā)酵48 h后,對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心(6000 r/min,4 ℃離心10 min)處理后取上清。按照L/D-LACTATE試劑盒說(shuō)明，分別對(duì)五種凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液中的L-乳酸和D-乳酸含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.2 L-乳酸光學(xué)純度的計(jì)算 根據(jù)1.2.3.1方法分別測(cè)定五種凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵48 h后L-乳酸ML(g/L)和D-乳酸MD(g/L)的生產(chǎn)量,L-乳酸的光學(xué)純度計(jì)算公式為:

1.2.3.3 殘?zhí)呛康臏y(cè)定 利用葡萄糖試劑盒對(duì)五種凝結(jié)芽孢桿菌48 h發(fā)酵后的殘?zhí)呛窟M(jìn)行測(cè)定,具體的測(cè)定方法參考葡萄糖試劑盒中說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050乳酸發(fā)酵過(guò)程中指標(biāo)的變化測(cè)定 根據(jù)1.2.2方法對(duì)五種凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行48 h發(fā)酵,但在發(fā)酵過(guò)程中每隔5 h取一次樣,每次取樣后離心(6000 r/min,4 ℃離心10 min)處理取上清,對(duì)每個(gè)樣品利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、pH計(jì)、生物傳感分析儀和葡萄糖試劑盒分別進(jìn)行OD600、pH、L-乳酸和殘?zhí)呛康臏y(cè)定。最后以培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo),分別繪制凝結(jié)芽孢桿菌OD600、pH、L-乳酸和殘?zhí)堑陌l(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)。

1.2.5 凝結(jié)芽孢桿菌基因組的提取 對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050進(jìn)行基因組提取。將凝結(jié)芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),50 ℃,200 r/min,當(dāng)OD600達(dá)到1～2時(shí),取2 mL菌液到滅菌離心管中,12000 r/min,4 ℃離心2 min收集菌體。利用細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒對(duì)菌體進(jìn)行基因組的提取,具體提取的方法參考試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.6 凝結(jié)芽孢桿菌總RNA的提取 對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050中l(wèi)dhL1、ldhL2和ldhD三個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄情況分析,分別在菌體培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期(5 h)、穩(wěn)定期(20 h)和衰亡期(45 h)時(shí)收集菌體提取RNA。將凝結(jié)芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達(dá)到1～2時(shí),取2 mL菌液于滅菌離心管中,12000 r/min,室溫離心2 min收集菌體,之后參考AxyPrep總RNA小量制備試劑盒說(shuō)明書(shū)中的從細(xì)菌中提取總RNA的操作步驟進(jìn)行。

1.2.7 RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA 將提取好的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測(cè),對(duì)ldhL1、ldhL2和ldhD三個(gè)基因設(shè)計(jì)三對(duì)引物(RTldhL1-F/RTldhL1-R、RTldhL2-F/RTldhL2-R、RTldhD-F/RTldhD-R),引物序列見(jiàn)表1。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA過(guò)程按照PrimeScript cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.8 RT-PCR反應(yīng) 在八聯(lián)管中加入SYBR Premix Dimer Eraser(2×)10 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,模板cDNA 2 μL,滅菌蒸餾水 6 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為95 ℃,30 s;95 ℃,5 s,60 ℃,30 s,40個(gè)循環(huán);4 ℃,維持。反應(yīng)結(jié)束后,可以得到其擴(kuò)增曲線(xiàn)并可根據(jù)循環(huán)數(shù)進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,數(shù)據(jù)采用SPSS軟件處理并用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種凝結(jié)芽孢桿菌乳酸發(fā)酵48 h指標(biāo)(生長(zhǎng)情況)的測(cè)定

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,五種凝結(jié)芽孢桿菌L型乳酸的產(chǎn)量明顯比D型乳酸的產(chǎn)量高,并由此可以計(jì)算出五種凝結(jié)芽孢桿菌L-乳酸的光學(xué)純度,即五種凝結(jié)芽孢桿菌的L-乳酸光學(xué)純度都達(dá)到了97%以上,ATCC7050、36D1和HL5的L-乳酸光學(xué)純度甚至達(dá)到99%以上,說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌主要生產(chǎn)L型乳酸。凝結(jié)芽孢桿菌P4-102B發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮繛?5.37 g/L,但只生成了18.42 g/L的乳酸,其所消耗的葡萄糖并沒(méi)有全部轉(zhuǎn)化成乳酸,葡萄糖的消耗可能進(jìn)入到其他的代謝途徑中。

表2 五種凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵48 h實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of five Bacillus coagulans strains after 48 h fermentation

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050乳酸發(fā)酵過(guò)程中指標(biāo)變化情況

2.2.1 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050生長(zhǎng)曲線(xiàn)中OD值變化 生長(zhǎng)過(guò)程曲線(xiàn)如圖1所示,凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050由于經(jīng)過(guò)了活化,其延遲期很短,凝結(jié)芽孢桿菌在復(fù)合培養(yǎng)基中短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行快速生長(zhǎng),即在0～10 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在10～30 h凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞因生長(zhǎng)中不利因素的增多,其生長(zhǎng)速度變慢達(dá)到穩(wěn)定期,在30 h以后凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞基本停止增長(zhǎng),即達(dá)到細(xì)胞的衰亡期。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050發(fā)酵中細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程Fig.1 Profiles of cell growth in Bacillus coagulans ATCC7050 fermentation

2.2.2 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液pH的變化 從圖2可以看出,凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050在發(fā)酵0～5 h時(shí)發(fā)酵液的pH迅速降低,5～10 h的pH下降速度變慢,10 h之后發(fā)酵液的pH基本維持了穩(wěn)定。發(fā)酵液中pH的調(diào)節(jié)主要是依靠發(fā)酵搖瓶中的碳酸鈣來(lái)調(diào)節(jié),在發(fā)酵開(kāi)始時(shí),乳酸的合成使發(fā)酵液中懸浮起來(lái)的碳酸鈣被消耗,從而使發(fā)酵液的pH降低,隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，搖瓶底部碳酸鈣不斷被懸浮到發(fā)酵液中,使發(fā)酵液的pH維持穩(wěn)定。

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050發(fā)酵中發(fā)酵液pH變化Fig.2 Change of pH in fermentation broth of Bacillus coagulans ATCC7050

2.2.3 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050發(fā)酵過(guò)程中L-乳酸含量和葡萄糖含量的變化 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050利用葡萄糖生產(chǎn)L-乳酸的發(fā)酵過(guò)程如圖3所示,在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，乳酸的生成速率基本維持不變,隨著發(fā)酵過(guò)程到達(dá)后期(35 h以后)，凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞也達(dá)到衰亡期，乳酸的生成速率明顯變緩。凝結(jié)芽孢桿菌乳酸的合成過(guò)程為葡萄糖的轉(zhuǎn)化過(guò)程,其發(fā)酵液中葡萄糖的變化過(guò)程如圖4所示,葡萄糖在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)的消耗速率較快,到發(fā)酵后期(35 h以后)葡萄的消耗速率明顯變緩,與乳酸的生成過(guò)程含量變化相反。

圖3 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050 L-乳酸的生產(chǎn)過(guò)程Fig.3 Profiles of L-lactic acid fermentation by Bacillus coagulans ATCC7050

圖4 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050 發(fā)酵液中葡萄糖的變化Fig.4 Change of glucose in fermentation broth of Bacillus coagulans ATCC7050

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050乳酸脫氫酶基因的確定

根據(jù)NCBI中凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050全基因組信息對(duì)ldhL1、ldhL2和ldhD三個(gè)乳酸脫氫酶基因分別設(shè)計(jì)引物(LdhL1-F/LdhL1-R、LdhL2-F/LdhL2-R、LdhD-F/LdhD-R),引物序列見(jiàn)表1,進(jìn)行PCR。PCR電泳結(jié)果如圖5所示,泳道1位ldhL1基因PCR,ldhL1基因的擴(kuò)增片段大小應(yīng)為1075bp;泳道2為ldhL2基因PCR,ldhL2基因的擴(kuò)增片段大小應(yīng)為1053bp;泳道3為ldhD基因PCR,ldhD基因的擴(kuò)增片段大小應(yīng)為1068bp,三個(gè)基因的PCR擴(kuò)增片段大小驗(yàn)證正確,說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050中存在有l(wèi)dhL1、ldhL2和ldhD三個(gè)基因。

圖5 ldhL1、ldhL2、ldhD基因PCR結(jié)果Fig.5 PCR results of ldhL1,ldhL2 and ldhD genes注:M:DL5000;泳道1為ldhL1基因PCR;泳道2為ldhL2基因PCR;泳道3為ldhD基因PCR。

2.4 對(duì)ldhL1、ldhL2和ldhD三個(gè)基因轉(zhuǎn)錄情況分析

對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050中l(wèi)dhL1、ldhL2和ldhD三個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄情況分析,其電泳結(jié)果如圖6所示,ldhL1和ldhD基因分別以對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的cDNA為模板PCR擴(kuò)增出正確條帶,表明ldhL1和ldhD基因在對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期都有轉(zhuǎn)錄;ldhL2基因分別以對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的cDNA為模板PCR沒(méi)有擴(kuò)增出條帶,表明ldhL2基因在對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期未進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

圖6 cDNA PCR結(jié)果Fig.6 Results of cDNA PCR注:M:DL500;泳道1～3、4～6、7～9分別為ldhL1基因、ldhL2基因和ldhD基因在對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的PCR結(jié)果。

對(duì)ldhL1和ldhD基因在對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測(cè)定,其結(jié)果如圖7所示,ldhL1和ldhD基因的轉(zhuǎn)錄水平隨細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程逐漸降低,ldhL1基因的轉(zhuǎn)錄水平在任何細(xì)胞生長(zhǎng)期都要高于ldhD的轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)數(shù)期ldhL1基因的轉(zhuǎn)錄水平約為ldhD基因轉(zhuǎn)錄水平的68倍,穩(wěn)定期ldhL1基因的轉(zhuǎn)錄水平約為ldhD基因轉(zhuǎn)錄水平的96倍,衰亡期ldhL1基因的轉(zhuǎn)錄水平約為ldhD基因轉(zhuǎn)錄水平的63倍。綜上結(jié)果,ldhL1基因是凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050 L-乳酸生產(chǎn)的最主要基因,可以作為對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌研究的表型基因。

圖7 凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050的ldhL1(A)和ldhD(B)基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.7 Transcriptional level of ldhL1(A)and ldhD(B) gene of Bacillus coagulans ATCC7050

3 結(jié)論

五種凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)ATCC7050、36D1、HL5、HL5-C和P4-102B主要生產(chǎn)L-乳酸,其光學(xué)純度在97%以上。乳酸脫氫酶是凝結(jié)芽孢桿菌乳酸生產(chǎn)的關(guān)鍵酶,ATCC7050菌株中與乳酸合成直接相關(guān)的基因—三種乳酸脫氫酶基因:ldhL1、ldhL2和ldhD在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期轉(zhuǎn)錄情況研究結(jié)果表明,ldhL1基因是凝結(jié)芽孢桿菌ATCC7050 L-乳酸合成相關(guān)的關(guān)鍵基因;ldhL2基因在菌體內(nèi)并未轉(zhuǎn)錄;ldhD基因在ATCC7050中的轉(zhuǎn)錄水平較ldhL1基因轉(zhuǎn)錄水平明顯要低,在不同生長(zhǎng)階段ldhL1基因轉(zhuǎn)錄水平是ldhD基因轉(zhuǎn)錄水平的63～96倍,這是凝結(jié)芽孢桿菌主要生產(chǎn)L-乳酸的重要原因。