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(1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海 200237; 2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,勁牌研究院,勁牌有限公司,湖北大治 435100; 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心,上海 201203)

板栗(CastaneamollissimaBlume)是殼斗科(Fagaccac)栗屬堅果類植物的果實(shí),又名栗、栗子、風(fēng)栗等,是我國特產(chǎn)植物。板栗殼是板栗在深加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為板栗殼藥性甘、澀、平,具有降逆、止血的功效,主治反胃、便血等癥[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明,板栗殼具有較強(qiáng)的抗氧化性、抗癌、治療糖尿病和抗病毒活性[2-5]。板栗殼中含有大量的天然棕色素,是目前世界上并不多見的性質(zhì)穩(wěn)定的天然色素之一[6-7],由于其使用穩(wěn)定、安全性高、色澤正宗,已作為色素添加劑，應(yīng)用于保健酒、可可奶等中[8-9]。

目前針對板栗殼中棕色素的研究主要集中在提取工藝優(yōu)化、使用穩(wěn)定性考察、著色效果評價等方面[6-7,10-13]，對于其藥理活性、化學(xué)成分組分及純化制備的研究較少。板栗殼棕色素具有作為優(yōu)良天然色素的開發(fā)潛能,若對其藥理活性和化學(xué)成分等方面的認(rèn)識不足,將無法為后續(xù)的毒理學(xué)和安全性評價提供有力依據(jù),從而限制其作為天然食用色素的實(shí)際應(yīng)用。

目前,大力開發(fā)天然色素等天然食品添加劑是食品添加劑發(fā)展的主體趨勢。因此,為充分利用板栗殼棕色素這一優(yōu)良的天然色素,為其安全評價和實(shí)際應(yīng)用打好基礎(chǔ),本文開展了光譜分析、含量測定、體外抗氧化活性測定及色譜分離純化等工作,對板栗殼棕色素的藥理活性和化學(xué)組成進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板栗 購于湖北省大治市當(dāng)?shù)厥袌?收集其外果皮并粉碎;沒食子酸(gallic acid) 北京百靈威科技有限公司;無水碳酸鈉(Na2CO3) 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司;福林酚(Folin-Ciocalteu)(生物試劑) 上海麥克林生化科技有限公司;苯酚(化學(xué)純) 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;硫酸(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、二喹啉甲酸(bicinchonininc acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒 上海翊圣生物科技有限公司;甲醇、乙醇(制備級) 上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?乙腈(色譜級) 北京百靈威科技有限公司。

NICOLET 6700型傅里葉紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司;UV2400PC型紫外可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;KH200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)儀器有限公司;ASE-12/16/24固相萃取裝置 天津奧特塞恩斯儀器有限公司;BONA-GM-M22陶瓷膜中試型實(shí)驗(yàn)機(jī)、BONA-GM-18超濾-微濾-納濾膜分離實(shí)驗(yàn)機(jī) 濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司;Waters Alliance型高效液相色譜儀(包括2695四元梯度泵、2489 UV-Vis檢測器、自動進(jìn)樣器和柱溫箱；數(shù)據(jù)采集與處理用Empower 3控制)、ACQUITY TQD串聯(lián)四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(電噴霧離子源,包含正、負(fù)離子模式,用Masslynx 4.1工作站控制)、Waters Alliance自動純化系統(tǒng)(包括2545二元梯度泵,2767餾分收集器,2489 UV-vis檢測器和自動進(jìn)樣器,由Masslynx 4.1軟件處理控制) 美國沃特世公司;AVANCE Ⅲ 500型超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振波譜儀 Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 板栗殼棕色素的提取 將板栗殼用粉碎機(jī)粉碎成直徑小于1 cm的碎片,加入20倍量的40%乙醇，于75 ℃下提取3次,每次2 h。經(jīng)棉花粗濾后,用50 nm的陶瓷膜過濾,獲得的濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3～4,靜置15 min使其充分沉淀后，于4400 r/min下離心10 min,再將獲得的沉淀溶解于pH為6～7的純水中,保持?jǐn)嚢柚脸隹跍囟冗_(dá)85 ℃,噴霧干燥后獲得粉末狀板栗殼棕色素,色率在7000～11000 EBC間。

1.2.2 紫外光譜分析 取少量棕色素溶于水中,在UV2400PC紫外可見分光光度計下,于200～800 nm的紫外-可見光區(qū)域進(jìn)行掃描。

1.2.3 紅外光譜分析 瑙乳缽將板栗殼棕色素研細(xì),然后加入適量干燥的溴化鉀并研磨均勻,壓成片狀,用傅里葉紅外光譜儀于4000～500 cm-1的紅外區(qū)掃描。

1.2.4 板栗殼棕色素中總多酚、多糖和蛋白質(zhì)的含量測定

1.2.4.1 總多酚含量的測定 精密稱定10.00 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,搖勻。精確量取0.20、0.40、0.80、1.25、1.50、2.00 mL沒食子酸對照品溶液于10 mL容量瓶中,加入0.50 mL Folin-Ciocalteu試劑,充分搖勻,靜置2 min,加入3.00 mL 7.5% Na2CO3溶液,再加水至刻度,搖勻,在室溫下反應(yīng)60 min。以相應(yīng)的試劑為空白,在760 nm處測定吸光值,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。板栗殼棕色素中總多酚的含量測定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法。

式中:E為多酚百分含量,C為顯色液中多酚含量(μg/mL),V為樣品液體積(mL),m為式樣質(zhì)量(g),n為稀釋倍數(shù)。

1.2.4.2 多糖含量的測定 精密稱取105 ℃干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖4.20 mg于50 mL容量瓶中,加水溶解并定容至刻度。精確量取葡萄糖對照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL,分置于具塞試管中,各加蒸餾水使體積為2.00 mL,再各加約5%的苯酚液1.00 mL,搖勻,迅速滴加硫酸5.00 mL,搖勻后放置5 min,置于沸水浴中加熱15 min,取出冷卻至室溫;另加蒸餾水2.00 mL,加苯酚液和硫酸,同上操作為空白對照。于490 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。板栗殼棕色素中多糖的含量測定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法。

式中:W為多糖的百分含量,ρ為顯色液中葡萄糖含量(μg/mL),f為葡萄糖換算多糖的換算因素,m為試樣質(zhì)量(g),V為吸取待測液體積(mL)。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:配制1.44 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,依次精確稀釋到其濃度的80%、60%、40%、20%。分別取5 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入到微孔板中,加入200 μL BCA工作液,振蕩30 s充分混勻,蓋上微孔板,37 ℃孵育30 min。另取蒸餾水5 μL于微孔板中,加入200 μL BCA工作液,并按上述方法孵育,于595 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。板栗殼棕色素中蛋白質(zhì)的含量測定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法。

式中:W為蛋白質(zhì)百分含量,C為顯色液中蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),V為樣品液體積(mL),m為式樣質(zhì)量(g),n為稀釋倍數(shù)。

1.2.5 板栗殼棕色素的DPPH自由基清除能力 準(zhǔn)確移取50、100、200、400、500 μL濃度為20 mg/mL的板栗殼棕色素50%乙醇溶液于容量瓶中,加入4 mL DPPH自由基溶液(0.25 mmol/L),再用50%乙醇定容于10 mL,振蕩搖勻后,常溫避光暗反應(yīng)30 min后于517 nm處測定吸光值,按如下公式計算各溶液對DPPH自由基的清除率[17]。以式樣的質(zhì)量溶度對DPPH自由基清除率作圖,得到DPPH自由基清除率為50%的所需要樣品的質(zhì)量濃度為IC50。

DPPH自由基清除率(%)=1-(A-A1)/A0

式中:A0為溶劑空白對照吸收度;A1為樣液與溶劑混合后的吸光度;A為樣液與DPPH自由基溶液混合后的吸光度。各組平行測定3次,取平均值。

1.2.6 板栗殼棕色素的色譜分離純化 板栗殼棕色素第一次反相制備條件:色譜柱Unitary C18(250×20 mm i.d.,10 μm),以(A)0.2% FA(v/v)水-(B)0.2% FA(v/v)甲醇為流動相;梯度洗脫:0～5 min,20% B,5～40 min,20～72% B,流速為20.0 mL/min;檢測波長為245 nm;進(jìn)樣量為800 μL。

板栗殼棕色素7個組分的第二次反相制備條件:色譜柱采用Unitary C18(250×20 mm i.d.,10 μm),流速為20.0 mL/min。流動相、梯度洗脫條件、檢測波長、進(jìn)樣體積和樣品濃度見表1。表中流動相A1為水,B1為乙腈,C1為甲醇;A2為0.01% TFA(v/v)水,B2為0.01% TFA(v/v)乙腈;A3為0.1% FA(v/v)水,B3為0.1% FA(v/v)乙腈。

表1 棕色素中7個組分的第二次反相制備液相條件Table 1 2nd Prep-RPLC conditions of 7 fractions in brown pigment

1.2.7 化合物結(jié)構(gòu)鑒定 板栗殼棕色素中化合物的質(zhì)譜測定采用負(fù)離子模式;化合物的核磁共振1H譜和13C譜采用超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振波譜儀AVANCE Ⅲ 500完成,氘代試劑為DMSO-d6或CD3OD。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件(Microsoft Corporation)進(jìn)行統(tǒng)計分析,Origin 8.6專業(yè)版(Electronic Arts Inc)軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗殼棕色素的光譜特性

板栗殼棕色素采用紫外可見分光光度計進(jìn)行全波長掃描,發(fā)現(xiàn)棕色素的水溶液在276 nm處具有最大吸收峰,并隨著波長增加,其吸收值下降(圖1),這與張捷莉等[7]對50%乙醇提取出的板栗殼棕色素的紫外光譜特征一致。板栗殼棕色素的紅外譜圖具有典型的多酚類物質(zhì)的特征(圖2)。在3409.9 cm-1存在由v O-H對稱伸縮振動產(chǎn)生的寬而強(qiáng)的特征吸收峰,1383.5 cm-1存在羥基δ O-H面內(nèi)彎曲振動產(chǎn)生的吸收峰,說明板栗殼中的化合物存在酚羥基。2929.9 cm-1是亞甲基上v C-H反對稱伸縮振動引起的吸收峰。1613.3、1521.6和1446.8 cm-1主要是苯環(huán)上v C=C骨架振動產(chǎn)生的吸收峰和亞甲基δ C-H上面內(nèi)彎曲振動產(chǎn)生的吸收峰[18]。這結(jié)果與Yao等[19]對板栗殼3種不同極性提取部位的紅外表征結(jié)果十分相似,說明多酚類物質(zhì)為板栗殼中的主要成分。

圖1 板栗殼棕色素全波長掃描圖譜Fig.1 Full wavelength scanning spectra of brown pigment from Castanea mollissima Blume

圖2 板栗殼棕色素紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of brown pigment from Castanea mollissima Blume

2.2 板栗殼棕色素中總多酚、多糖和蛋白質(zhì)含量

板栗殼棕色素中多酚、多糖和蛋白質(zhì)的含量分別采用了Folin-Ciocalteu法、苯酚-硫酸顯色法和BCA法,測定得到三者含量分別為42.35%、13.75%和8.08%。所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍等信息如表2。

表2 板栗殼棕色素中多酚、多糖和蛋白質(zhì)的含量測定結(jié)果Table 2 Results of content determination of polyphenol,polysaccharide and protein in brown pigment of Castanea mollissima Blume shell

表2中板栗殼棕色素的含量測定結(jié)果說明,多酚類物質(zhì)是棕色素中的主要成分,與紅外光譜分析結(jié)果一致。同時,多糖和蛋白的含量也較高,三者含量加合為64.18%,是板栗殼棕色素中的主要物質(zhì)。于此同時,含量測定的結(jié)果對于板栗殼棕色素中化學(xué)成分的分離純化也提供了指導(dǎo)。為消除大分子物質(zhì)和糖類物質(zhì)對于后續(xù)色譜分離純化的各種不利影響,簡化其分離過程,采用了專門的前處理方法進(jìn)行去除。

2.3 板栗殼棕色素對DPPH自由基的清除能力

多酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)的重要二次代謝產(chǎn)物,其酚羥基結(jié)構(gòu)特別是鄰位酚羥基很容易被氧化為醌類物質(zhì),從而消耗了周圍環(huán)境中的氧,減少了組織中氧化反應(yīng)的發(fā)生,這就使得多酚類物質(zhì)具備較強(qiáng)的抗氧化活性和清除體內(nèi)自由基的能力。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究,已經(jīng)證實(shí)了多酚類物質(zhì)含量較為豐富的葡萄籽、紅棗等均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。為測定板栗殼棕色素的抗氧化活性,本文采用DPPH自由基清除法。從圖3中可以看出,板栗殼棕色素表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性,棕色素對DPPH自由基的清除能力隨著劑量的增加而增強(qiáng),存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度達(dá)到1 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率達(dá)到了91.96%。經(jīng)計算,板栗殼棕色素的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)為0.44 mg/mL。

圖3 板栗殼棕色素清除DPPH自由基能力Fig.3 Ability of scavenging DPPH free radical of the brown pigment

2.4 板栗殼棕色素的分離純化

板栗殼棕色素組成復(fù)雜,為簡化樣品,本文以板栗殼棕色素中的小分子次級代謝產(chǎn)物為分離目標(biāo),建立提取和前處理方法。采用甲醇提取、超濾(5000 Da)和反相固相萃取處理,分別去除其中的大分子和強(qiáng)極性組分,得到以小分子為主的磚紅色粉末狀固體。

板栗殼色素的第一次反相制備的色譜圖見圖4?？梢钥闯?棕色素中的小分子物質(zhì)十分復(fù)雜,表現(xiàn)在不僅組成復(fù)雜,而且相對含量上差異也較大,這為分離純化帶來了困難。第一次制備將樣品按照色譜峰分離為12個組分(Fr.1～Fr.12)。隨后按照各個組分的質(zhì)量和復(fù)雜程度,挑選Fr.2-Fr.8這7個組分進(jìn)行進(jìn)一步分離。如Fr.4的組成簡單,僅包含兩個分離度較好的色譜峰。以這兩個色譜峰為分離目標(biāo),采用連續(xù)進(jìn)樣的方式進(jìn)行色譜峰收集(圖5),最終從Fr.4得到兩個高純度化合物(化合物4和5,純度見圖6)。

圖4 板栗殼棕色素的第一次反相制備色譜圖Fig.4 First preparative RPLC chromatograms of brown pigment from Castanea mollissima Blume shell

圖5 4號組分的第二次制備色譜圖Fig.5 Second preparative HPLC Chromatograms of Fr.4

圖6 10個化合物的純化制備過程Fig.6 Purification and preparation of 10 compounds

2.5 板栗殼棕色素的化學(xué)成分鑒定

從板栗殼棕色素中分離鑒定了10個多酚類化合物,各個化合物的編號及來源見圖6所示。采用峰面積歸一化法計算表明化合物的純度均達(dá)到90%以上。采用高分辨質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)對這些化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,其化合物結(jié)構(gòu)鑒定如下:

化合物1:ESI-MS m/z:109.0[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.95(1H,t,J=7.8 Hz,H-5)6.27(1H,s,H-2)6.25(2H,s,H-4,6);13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:159.7(C-1,3),131.0(C-5),107.8(C-4,6),103.6(C-2)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]對照基本一致,故鑒定該化合物為Resorcinol(間苯二酚)。

化合物2:ESI-MS m/z:167.0[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.42(2H,m,H-2,6),6.85(1H,m,H-5);13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:199.6(C=O),153.1(C-4),145.9(C-3),127.2(C-1),122.7(C-6),116.1(C-5),115.6(C-2),66.1(CH2)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]對照基本一致,故鑒定該化合物為2-hydroxy-3′,4′-dihydroxyacetophenone(2-羥基-3′,4′-二羥基苯乙酮)。

化合物3:ESI-MS m/z:109.3[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:6.72(2H,m,H-3,6),6.60(2H,m,H-4,5);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:145.4(C-1,2),119.4(C-4,5),115.8(C-3,6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]對照基本一致,故鑒定該化合物為Catechol(鄰苯二酚)。

化合物4:ESI-MS m/z:137.3[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:9.69(1H,s,CHO),7.27(1H,dd,J=2.0,10.0 Hz,H-6),7.24(1H,d,J=2.0 Hz,H-5),6.91(1H,d,J=8.0 Hz,H-2);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:191.0(CHO),152.3(C-4),145.9(C-3),128.7(C-1),124.5(C-6),115.5(C-5),114.2(C-2)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]對照基本一致,故鑒定該化合物為Protocatechualdehyde(原兒茶醛)。

化合物5:ESI-MS m/z:183.4[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:6.93(2H,s,H-2,6),3.73(3H,s,-CH3).13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:166.9(C=O),145.1(C-3,5),139.2(C-4),119.7(C-1),108.9(C-2,6),52.1(-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]對照基本一致,故鑒定該化合物為3,4,4-trihydroxy-benzoic acid methyl ester(沒食子酸甲酯)。

化合物6:ESI-MS m/z:151.1[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:2.48(3H,s,CH3),6.81(1H,d,J=7.5 Hz,H-3),7.41(1H,m,H-6).13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:199.7(C=O),156.2(C-5),146.3(C-2),130.6(C-1),123.6(C-4),116.0(C-6),115.8(C-3),26.2(COCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]對照基本一致,故鑒定該化合物為2,5-dihydroxyacetophenone(2,5-二羥基苯乙酮)。

化合物7:ESI-MS m/z:197.4[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.6(1H,dd,J=1.6,8.3 Hz,H-6),7.55(1H,d,J=1.6 Hz,H-2),6.87(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),3.94(3H,t,J=6.2 Hz,OCH3),3.91(2H,s,H-3′),3.17(2H,t,J=6.2 Hz,H-2′).13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:199.8(C-1′),153.5(C-4),149.2(C-3),130.8(C-1),124.9(C-6),116.9(C-5),112.0(C-2),59.1(C-3′),56.5(OCH3),41.8(C-2′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]對照基本一致,故鑒定該化合物為β-hydroxypropiovanillone(β-羥丙基香草酮)。

化合物8:ESI-MS m/z:167.4[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.34(1H,d,J=2.1 Hz,H-2),7.30(1H,dd,J=2.1,8.2 Hz,H-6),6.79(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),3.3(3H,s,H-8).13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:166.1(-COOR),150.5(C-4),145.0(C-3),121.7(C-6),120.7(C-1),116.1(C-2),115.2(C-5),51.5(-CH3).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]對照基本一致,故鑒定該化合物為protocatachuic acid methy ester(原兒茶酸甲酯)。

化合物9:ESI-MS m/z:163.1[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.59(1H,d,J=15.9 Hz,H-β),7.44(2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6),6.77(2H,d,J=8.6 Hz,H-3,5),6.28(1H,d,J=15.9 Hz,H-α),13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:171.6(-COOH),161.6(C-4),147.0(C-β),131.5(C-3,5),127.7(C-1),117.2(C-1),116.2(C-α).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]對照基本一致,故鑒定該化合物為2-propenoic acid(對香豆酸)。

化合物10:ESI-MS m/z:193.1[M-H]-;1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.58(1H,d,J=15.9 Hz,H-7),7.17(1H,s,H-2),7.05(1H,d,J=7.8 Hz,H-5),6.81(1H,d,J=8.2 Hz,H-4),6.30(1H,d,J=15.8 Hz,H-8),3.89(1H,s,-OCH3).13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:171.6(C-9),150.4(C-3),149.4(C-4),145.4(C-7),127.9(C-1),123.9(C-6),116.4(C-2,5),111.6(C-8),56.4(-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]對照基本一致,故鑒定該化合物為Ferulic Acid(阿魏酸)。

3 結(jié)論

板栗殼棕色素顯示出很強(qiáng)的光譜特性。其紫外光譜在276 nm下有最大吸收,而紅外光譜顯示出明顯的多酚類物質(zhì)特征。采用紫外分光光度法測定發(fā)現(xiàn),棕色素中總多酚、多糖和蛋白質(zhì)的含量分別為42.35%、13.75%和8.08%,加合為64.18%,是棕色素中的主要成分。板栗殼棕色素也顯示出較強(qiáng)的抗氧化活性,其抗氧化活性呈現(xiàn)明顯的量-效關(guān)系,在1 mg/mL時,對DPPH自由基清除率可達(dá)91.96%,其IC50值為0.44 mg/mL。

為進(jìn)一步探索板栗殼棕色素抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ),同時有助于其毒理和安全評價,本研究采用色譜方法,通過兩次制備,從棕色素中分離得到10個化合物,經(jīng)過質(zhì)譜和核磁確證均為多酚類化合物,經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研,未見在關(guān)于板栗殼的文獻(xiàn)中有過相關(guān)報道。