, , , , ,徐君

(1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局,浙江舟山 316021; 2.浙江海洋大學(xué),浙江舟山 316021)

食品保鮮技術(shù)主要包括物理、化學(xué)和生物方法。物理方法因使用范圍、操作技術(shù)等限制,推廣受限,如微波殺菌難以評估殺菌的效果和安全性[1];紅外殺菌穿透力并不強(qiáng),只適合食品表面殺菌[2];輻照殺菌的機(jī)理及輻射降解藥物殘留的安全性有待進(jìn)一步研究[3]。化學(xué)防腐劑如亞硝酸鹽、苯甲酸鈉等都具有一定的毒性,而生物保鮮具有無毒、無味、安全等特點(diǎn)。因此尋找安全無毒的生物保鮮方法,用于取代化學(xué)保鮮方法已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，在抗菌保鮮天然成分的研究上,較多的集中在從陸生植物中提取的抗菌活性成分方面,而從海洋生物中尋找抗菌活性成分的研究,雖然涉及到殼聚糖、海藻低聚糖等,但與海洋巨大的資源相比,是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

我國貝殼資源極其豐富且品種繁多,近年來貝類的產(chǎn)量和加工量每年已達(dá)到數(shù)百萬噸甚至上千萬噸[4],但同時(shí)產(chǎn)生大量的廢棄物,每年都有數(shù)百萬噸的空貝殼被丟棄在海岸邊,破壞環(huán)境。因此國內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注廢棄貝殼的利用。在環(huán)境治理領(lǐng)域,有報(bào)道稱將貝殼熱解成CaO,可除富營養(yǎng)化水體中的磷污染[5]、去除廢水中的重金屬[6-7],在生物濾池中加貝殼作為填料,可用于工業(yè)廢水處理[8]。在食品領(lǐng)域,除部分貝殼作為肥料和禽畜飼料的添加劑外[9],研究還表明，煅燒貝殼粉可以用于去除水果蔬菜表面農(nóng)藥殘留[10],具有較強(qiáng)的除菌和脫臭能力[11],經(jīng)高溫灼燒后制取活性氧化鈣,對豬瘦肉、豆腐干[12]、儲糧霉菌[13]具有防腐抑菌效果。任慧等[14]研究了扇貝對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果,魏巍等[15]用扇貝對黃瓜、單環(huán)刺縊扇貝進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn),但未見系統(tǒng)地研究貝殼粉煅燒物對常見致病菌的殺菌及抑菌效果的報(bào)道。因此,本文選取文蛤、貽貝、縊蟶這3種常見貝殼,經(jīng)高溫煅燒獲得貝殼煅燒粉,評估其對常見致病菌的殺菌以及抑菌能力,研究貝殼煅燒粉作為天然保鮮劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

文蛤、貽貝、縊蟶 浙江省舟山市南珍鮮活海產(chǎn)品市場;大腸埃希氏菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙門氏菌(CMCC50115) 廣東省微生物菌種保藏中心;副溶血弧菌(CICC 21617) 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;腦心浸液肉湯、DHL瓊脂、Barid-Parker瓊脂、EMB瓊脂、TCBS瓊脂 北京陸橋生物技術(shù)有限公司;氯化鈉(分析純) 國藥集團(tuán);菌落計(jì)數(shù)紙片 3M公司。

SX2-2.5-12型高溫馬福爐 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;QE型高速中藥粉碎機(jī) 武義縣屹立工具有限公司;BK1610培養(yǎng)箱 THERMO德國公司;KS12生物安全柜 THERMO德國公司;MLS-3750高壓滅菌鍋 日本三洋;ME2002E電子天平 瑞士梅特勒公司;IKA MS3混合器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;Advantage10純水儀 德國Milipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 貝殼煅燒粉的制備 材料預(yù)處理:將貽貝、文蛤、溢蟶于適量水中煮至貝殼自然開口,取出貝殼閉殼肌及內(nèi)臟等內(nèi)容物,將貝殼沖洗干凈,于自然條件下晾干,稱取適量于中藥粉碎機(jī)中粉碎5 min,粉碎3次,過150目篩,備用。

高溫煅燒:稱取適量粉碎好的貝殼粉于6個(gè)坩堝中,每2個(gè)坩堝設(shè)為一組,每組溫度分別為1000 ℃,煅燒時(shí)間為2 h。然后將貝殼粉置于烘箱中,以180 ℃烘干20 min,于干燥器內(nèi)冷卻后備用。通過稱量貝殼粉灰化前后質(zhì)量,計(jì)算貝殼粉失重率,確認(rèn)貝殼粉灰化完全[16]。

1.2.2 貝殼煅燒粉懸濁液的制備 將1.2.1所得的3種貝殼煅燒粉,用0.85% NaCl生理鹽水配成10%濃度的母液備用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,將10%濃度的貝殼煅燒粉母液稀釋成1%、0.1%、0.01%濃度的貝殼煅燒粉懸濁液。

1.2.3 受試菌株準(zhǔn)備 將實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌和沙門氏菌接種于腦心浸液肉湯(副溶血弧菌為鹽度2% NaCl的腦心浸液肉湯)培養(yǎng)基,36 ℃活化培養(yǎng)(24±2) h后,分別劃EMB平板、Baird-Park平板,TCBS平板和DHL平板,36 ℃培養(yǎng)(24±2) h,分別挑取典型單菌落接種于90 mL的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中(副溶血弧菌接種到2% NaCl的腦心浸液),36 ℃培養(yǎng)(18±2) h,使每毫升培養(yǎng)液中初始菌數(shù)達(dá)108CFU/mL以上,作為受試菌株。利用3M菌落總數(shù)測試片進(jìn)行菌落總數(shù)測定。

1.2.4 貝殼煅燒粉抑菌能力的測定

1.2.4.1 貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用研究 吸取10%濃度的貝殼煅燒粉懸浮液10 mL,分別加入到90 mL含不同菌的菌懸液中,制成1%濃度的貝殼煅燒粉混合液。該混合液中,初始菌達(dá)108CFU/mL以上,分別于26 ℃下作用1、5、10、20、30 min后,適當(dāng)稀釋后,利用3M紙片進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4.2 貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用研究 本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法的牛津杯[17]評價(jià)貝殼粉抑菌劑的抑菌活力。通過抑菌圈直徑的大小來確定抑菌劑抑菌能力的強(qiáng)弱。將復(fù)活的菌種接種于盛有普通細(xì)菌培養(yǎng)基的克氏瓶中,36 ℃培養(yǎng)(20±2) h后,用滅菌生理鹽水洗下菌苔,制成菌懸液。將菌懸浮液接種至pH7.2的瓊脂液(副溶血弧菌接種到含2% NaCl的瓊脂液)中,直至濃度為5×105CFU/mL瓊脂。將20 mL被接種過的瓊脂液倒在平板上,然后放在冷的平板上冷卻。

用無菌鑷子將滅菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中,在水平放置的培養(yǎng)皿中均勻放置3只牛津杯。用移液槍精準(zhǔn)吸取0.1、0.01、0.001 g/mL三個(gè)濃度的貝殼粉抑菌劑200 μL至牛津杯中。同時(shí)吸取無菌水作為對照。將加入抑菌劑的培養(yǎng)皿在(3～4) ℃冰箱中靜置30 min,然后在受試菌最適生長溫度37 ℃下,培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈直徑。平行實(shí)驗(yàn)3次,求其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用

由表1～表3可知,3種貝殼煅燒粉對4種菌均具有殺菌作用,但殺菌效果不同。貽貝殼煅燒粉對4種菌的作用大小為:大腸桿菌>副溶血弧菌>沙門氏菌>金黃色葡萄球菌;文蛤殼煅燒粉:副溶血弧菌>大腸桿菌>沙門氏菌>金黃色葡萄球菌;縊蟶殼煅燒粉:副溶血弧菌>大腸桿菌≈沙門氏菌>金黃色葡萄球菌。相比于大腸桿菌、沙門氏菌以及副溶血弧菌,3種貝殼煅燒粉對金黃色葡萄球菌的殺菌作用較弱,表明3種煅燒貝殼粉對于G-菌的殺菌作用明顯大于G+菌。推測可能由于G+菌因細(xì)胞壁由肽聚糖及磷壁酸所組成,結(jié)構(gòu)堅(jiān)硬且較厚;G-菌細(xì)胞壁所含的肽聚糖較薄,約為革蘭氏陽性菌細(xì)胞的十分之一,且無強(qiáng)化功能的磷壁酸,故較為脆弱,而其外層含有脂蛋白、磷脂、脂多糖等,于堿性環(huán)境下易受破壞而變性。

表1 貽貝貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用Table 1 Bactericidal effect of calcined shell powder of Mussels on food borne pathogens

表2 文蛤貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用Table 2 Bactericidal effect of calcined shell powder of Meretrix meretrix on food borne pathogens

表3 縊蟶貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用Table 3 Bactericidal effect of calcined shell powder of Sinonovacula constricta on food borne pathogens

相比于貽貝、文蛤,縊蟶對于4種菌的作用效果相對較強(qiáng)。對于沙門氏菌的殺菌作用,縊蟶>貽貝=文蛤,縊蟶作用10 min 后沙門氏菌小于10 CFU/mL;對于副溶血弧菌,作用效果最好的為文蛤以及縊蟶殼煅燒粉,作用5 min后,均小于10 CFU/mL;對于大腸桿菌,3種煅燒粉作用對其作用基本相同,作用10 min后均小于10 CFU/mL。對于金黃色葡萄球菌,縊蟶=貽貝>文蛤。

2.2 不同貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用

由培養(yǎng)基擴(kuò)散法初步確定貝殼煅燒粉對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌和大腸桿菌的抑菌能力大小。根據(jù)文獻(xiàn)[18]對抑菌作用的判斷:抑菌圈直徑小于或等于7 mm者,判為無抑菌作用。抑菌圈直徑大于7 mm者,有弱抑菌作用;抑菌圈在(10～20) mm者,有中等抑菌作用。抑菌圈直徑大于20 mm者,有強(qiáng)抑菌作用。由表4～表6,貝殼粉有抑菌作用,且不同貝殼粉對不同菌的抑菌效果不同。貽貝貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌性明顯強(qiáng)于沙門氏菌以及大腸桿菌,且在0.1 g/mL濃度下貽貝貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)16.24 mm。文蛤貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌性明顯強(qiáng)于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌,且在0.1 g/mL濃度下文蛤貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)16.00 mm?？O蟶殼煅燒粉在高濃度即0.1 g/mL對沙門氏菌的作用最強(qiáng),抑菌圈達(dá)16.42 mm,但在低濃度時(shí),對副溶血弧菌的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈達(dá)9.46 mm。

表4 貽貝貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用Table 4 Inhibitory effect of calcined shell powder of Mussels on food borne pathogens

表5 文蛤貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用Table 5 Inhibitory effect of calcined shell powder of Meretrix meretrix on food borne pathogens

表6 縊蟶貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用Table 6 Inhibitory effect of calcined shell powder of Sinonovacula constricta on food borne pathogens

3 結(jié)論

本文通過對沙門氏菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌進(jìn)行菌液的殺菌實(shí)驗(yàn)以及培養(yǎng)基擴(kuò)散法的抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，3種貝殼煅燒粉對4種菌均具有殺菌作用,但對金黃色葡萄球菌的殺菌作用較弱,對于G-菌的殺菌作用明顯大于G+菌。作用最強(qiáng)的為縊蟶及文蛤貝殼煅燒粉對副溶血弧菌，作用5 min后菌落總數(shù)均小于10 CFU/mL。由培養(yǎng)基擴(kuò)散法的抑菌實(shí)驗(yàn)表明，3種貝殼煅燒粉對4種菌均有抑菌作用：抑菌效果最強(qiáng)為縊蟶貝殼煅燒粉在0.1 g/mL濃度下作用于沙門氏菌，抑菌圈直徑達(dá)16.42 mm；在各濃度階段，貽貝和文蛤貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌性明顯強(qiáng)于于沙門氏菌以及大腸桿菌。因此不同的貝殼煅燒物都有一定的殺菌和抑菌作用,但效果有差異。因此進(jìn)一步對貝殼煅燒粉的成分進(jìn)行分析,將有助于對殺菌以及抑菌機(jī)理及效果的研究。本研究為貝殼煅燒粉用作食品抑菌劑進(jìn)行了初探。