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(1.江西旅游商貿(mào)職業(yè)學院經(jīng)濟管理學院,江西南昌 330100; 2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

果膠是一種廣泛存在于高等植物初生細胞壁和中胞層的重要酸性雜多糖,在食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)作為添加劑(如凝膠劑、增稠劑、乳化劑等)和功能因子(如預防和減少癌癥、抗氧化和促進腸道健康等)被廣泛應用[1]。然而日常食品加工過程中的高溫、酸堿、酶解及各種機械作用(如高壓均質(zhì)、剪切、靜高壓、超聲等)常導致果膠降解和功能性質(zhì)下降,進而制約其更大規(guī)模的工業(yè)化應用[2-3]。另一方面,果膠降解是解析其復雜大分子結構和研究結構與性質(zhì)間相互關系的重要手段[4]。由果膠降解制備得到的果膠低聚糖也具有更多生理活性[5]。因此,果膠的降解規(guī)律和機理備受研究人員的關注。

近年來,微波在各個行業(yè)的應用越來越廣泛。微波輔助提取技術也已成功用于果膠的提取[6],然而研究發(fā)現(xiàn),微波處理會造成果膠的降解,如Guo等[7]發(fā)現(xiàn),采用超靜壓提取的果膠分子量為3.06×105Da,而采用微波提取的果膠分子量僅為1.23×105Da。然而,關于果膠微波降解的研究很少探討微波對果膠分子鏈構象的影響。果膠為陰離子多糖,其分子鏈在溶液中會呈現(xiàn)不同的構象(如柔性任意卷曲、緊湊球形和剛性棒狀)[8]。多糖的分子鏈構象除了受到其本身性質(zhì)如分子質(zhì)量、分子修飾等的影響,溶劑、金屬離子、溫度、pH及物理場等外界條件都會對多糖大分子鏈構象產(chǎn)生影響。Antoniou等[9]研究了多糖在不同溶劑中的構象,結果表明在不同的溶劑中,多糖和溶劑的交聯(lián)作用不同,從而導致多糖在不同溶劑中有不同的構象。Foschiatti等[10]研究表明,不同陽離子的存在導致了多糖鏈局部構象的改變。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn),高溫可以誘導香菇多糖在NaCl溶液中的構象由三螺旋變?yōu)閱温菪?從伸展的鏈構象變?yōu)槔p結的鏈構象。Nilsson等[12]發(fā)現(xiàn),高壓均質(zhì)造成帶支鏈的改性淀粉顯著的降解和構象改變。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn),微波處理造成果膠分子量的降低和粘度的降低[13]。本文主要通過測定特征粘度，SEC-MALLS法和動靜態(tài)光散射法測定果膠構象,進一步對微波處理前后果膠構象的變化進行研究和表征,以期為微波處理造成果膠理化、功能性質(zhì)變化提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果果膠 中國上海Sigma Aldrich公司,半乳糖醛酸含量 71.68%;氯化鈉 北京康普匯維科技有限公司 分析純;疊氮鈉 分析純,杭州百思生物技術有限公司;氯化鈉 北京邁瑞達科技有限公司 色譜純。

EX1103ZH電子分析天平 北京西杰天平儀器有限公司;烏式粘度計 上海正慧工貿(mào)有限公司;DW-86L390超低溫冰箱 青島澳柯瑪超低溫冷凍設備有限公司;2.5 L真空冷凍干燥機 美國Labconco公司;絕對分子量表征系統(tǒng) 美國Brookhaven有限公司;X85-2S型恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;廣角靜動態(tài)光散射儀 美國Brookhaven有限公司;XH-200A電腦微波固液相合成/萃取工作站 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微波處理果膠 稱取果膠溶于100 mL的蒸餾水中,配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 g/100 mL(w/v)的果膠溶液,完全溶解后,移入三口燒瓶中,接通冷凝水,在微波條件680 W,100 ℃下,分別處理1、3、5、8、15、20、30 min。原果膠作為對照樣。

1.2.2 特性粘度的測定 特性粘度[η]采用烏氏粘度計方法進行測定。將1.2.1中處理的樣品首先在-80 ℃冷凍,然后在預冷的凍干機中-80 ℃,0.04 mbar壓力下冷凍干燥。所得樣品重新溶于0.1 mol/L的NaCl溶液中。先測定溶劑0.1 mol/L NaCl溶液流出毛細管的時間,再取10 mL樣品加入烏氏粘度計中,記錄溶液從毛細管中流出的時間,用5 mL 0.1 mol/L的NaCl溶液稀釋4次至果膠溶液,分別記錄其流出毛細管的時間,用哈金斯(Huggins)公式[14](公式1)建立曲線外推至0得樣品特性粘度。測定前樣品和溶劑均過0.45 μm的水系濾膜,測試在25 ℃的恒溫條件下進行。

ηsp/c=[η]+k×[η]2×c

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

式中:ηsp為增比粘度;[η]為特性粘度(dL/g);k為Huggins常數(shù);c為果膠濃度(g/mL);η為果膠溶液粘度(Pa·s);ηs為溶劑粘度(Pa·s);ηr為相對粘度;t1為樣品流出時間(s);t2為溶劑流出時間(s)。

1.2.4 動靜態(tài)光散射法測定果膠構象 取濃度為20 mg/mL經(jīng)微波處理不同時間后的果膠溶液,并過0.45 μm的水系濾膜,然后用已過濾膜的NaCl溶液分別稀釋至16、12、9、6、4、2、1 mg/mL,在波長633 nm下,選用角度30、45、60、75、90、105、120、135、150 °進行靜態(tài)測試,得果膠溶液的Zimm圖及均方回轉半徑Rg。

取濃度為20 mg/mL經(jīng)微波處理不同時間后的果膠溶液,用0.1 mol/L的NaCl溶液稀釋至1 mg/mL,波長633 nm,角度90 °進行動態(tài)光散射測試,得到果膠溶液的流體力學半徑Rh。

計算ρ=Rg/Rh,用于表征分子鏈的構象,ρ≈0.77時,高分子為球狀構象;ρ=1.0～1.1,高分子為松散的高支化鏈或聚合體;ρ=1.5～1.8,高分子為無規(guī)則線圈;ρ>2,高分子為伸展的剛性鏈[16]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均重復3次,采用SPSS 19.0中的方差分析(ANOVA)進行差異顯著性分析,以p<0.05表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 微波處理對果膠特性粘度的影響

特性粘度是考察多糖構象的一個重要參數(shù),能衡量既定溶劑中被單一聚合物鏈所占據(jù)的流體體積。由圖1可看出,隨著微波處理時間的延長,特性粘度降低。濃度0.5 g/100 mL的果膠,微波處理5、15、20、30 min,果膠的特性粘度從4.25 dL/g分別降低至3.35、3.10、2.97、2.85 dL/g。隨著微波處理時間的延長,分子間熱能變高,使果膠降解的程度變大,分子質(zhì)量變小,其特性粘度也越低[17]。且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,特性粘度的降低量減少,在微波處理30 min后,果膠質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 g/100 mL時,樣品特性粘度從4.25 dL/g分別降低至2.85、2.94、3.57、3.65 dL/g。果膠質(zhì)量濃度低,單位分子接收到的能量大,所以容易發(fā)生降解[18],造成粘度下降更多。另一方面,果膠濃度越高,分子間的接觸及交聯(lián)程度越大,粘度越高,微波處理后溶液中分子間交聯(lián)轉變的機會更大,其特性粘度減少量更小。因此,在日常加工過程中,發(fā)現(xiàn)微波處理后果膠粘度的下降,可能不只是因為果膠的降解,還與果膠構象的變化有關。

圖1 微波處理對不同質(zhì)量濃度果膠特性粘度的影響Fig.1 Effect of microwave treatment on the intrinsic viscosity of pectin of different mass concentrations

2.2 SEC-MALLS法表征果膠構象

SEC-MALLS法測得的果膠溶液的數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(MW)、平均分子量(MZ)、多分散性系數(shù)(MW/Mn)和均方回轉半徑(Rg)如表1所示。從表1中可以看出,隨著微波處理時間的延長,果膠的分子質(zhì)量及Rg均降低,微波處理30 min后,MW由原果膠的31.38×104Da降低至4.76×104Da,證明微波處理導致了果膠的降解。原果膠及微波處理后的果膠Mn、MW及MZ的大小順序為Mn

表1 原果膠及微波處理不同時間果膠的Mn、MW、MZ、MW/Mn、RgTable 1 The Mn,MW,MZ,MW/Mn and Rg of original pectin and pectin treated by microwave for different period

圖2分別為微波處理不同時間后果膠溶液的Rg和MW的雙對數(shù)圖,斜率即為α值。從圖2中可以看出,原果膠及微波分別處理5、15、20、30 min后,α值分別為0.57、0.59、0.51、0.54、1.00,表明原果膠及微波處理5、15、20 min后,果膠分子鏈構象為無規(guī)則線圈,而處理時間延長至30 min后,果膠分子的鏈構象發(fā)生改變,變?yōu)閯傂园魻?。這可能是因為長時間微波處理不僅打斷了果膠分子的糖苷鍵,同時還改變了果膠分子間及分子內(nèi)的交互作用如氫鍵,從而導致果膠分子的鏈構象發(fā)生改變。

圖2 原果膠及微波處理不同時間果膠的Mw和Rg的雙對數(shù)圖Fig.2 Logarithmic plot of the molecular weight(Mw)vs radius of gyration(Rg)of original pectin(A)and pectin treated by microwave for different period注:A:原果膠;B、C、D、E分別為微波處理5、15、20、30 min。

2.3 靜動態(tài)光散射法表征果膠構象

采用靜態(tài)光散射法測定不同濃度的果膠溶液,經(jīng)作Zimm圖可獲得樣品的均方回轉半徑(Rg),再結合動態(tài)光散射獲得樣品的流體力學半徑Rh,可計算ρ值,Rg、Rh、ρ值如表2所示。原果膠的Zimm圖如圖3所示,結合表2可知,原果膠ρ=1.49,以無規(guī)則線圈形狀存在于NaCl溶液中。微波分別處理5、15、20 min后,ρ分別為1.48、1.51、1.56,仍以無規(guī)則線圈存在與NaCl溶液中,構象沒有發(fā)生變化,微波處理時間延長至30 min后,ρ=2.12,果膠構象變?yōu)樯煺沟膭傂枣?。該結果與SEC-MALLS表征得到的果膠構象變化一致。Tsaih等[19]報道,多糖分子量越小,分子越伸展,剛性越強。本實驗中,微波造成果膠分子量降低,當分子量降低到4.76×104Da時,果膠表現(xiàn)出剛性。這可能是由于高分子量果膠更容易團聚或含有更多的中性糖含量,從而更易卷曲,而低分子量果膠則表現(xiàn)得更加具有剛性[20]。由于果膠降解是非可逆過程,因此微波處理造成的果膠構象變化也是不可逆的。另外,采用SEC-MALLS和靜態(tài)光散射都可以得到果膠的均方回轉半徑(Rg),對比表1和表2可以看出,使用靜態(tài)光散射法測得的Rg明顯大于SEC-MALLS法測得的結果,這可能是因為SEC-MALLS僅在一個角度、單一濃度下檢測,而靜態(tài)光散射是不同濃度的果膠溶液在不同散射角下測得,該結果與Liu等[15]的報道一致。

表2 原果膠及微波處理不同時間果膠的Rh、Rg及ρ(Rg/Rh)Table 2 The Rh、Rg and ρ(Rg/Rh)of original pectin and pectin treated by microwave for different period

圖3 靜態(tài)光散射所得原果膠溶液的Zimm圖Fig.3 The Zimm figure of pectin solution by static light scattering

3 結論

特征粘度法測定結果表明,微波處理5、15、20、30 min,果膠的特性粘度從4.25 dL/g分別降低至3.35、3.10、2.97、2.85 dL/g,說明隨著微波處理時間的延長,特性粘度降低。采用SEC-MALLS法和靜動態(tài)光散射法表征微波處理后果膠的構象,結果表明,短時間的微波處理對果膠溶液的構象不會產(chǎn)生影響,微波處理30 min后,果膠溶液的鏈構象由無規(guī)則線圈變?yōu)閯傂园魻睢；诠z“結構-構象-功能”之間的緊密聯(lián)系,微波處理后果膠構象發(fā)生不可逆改變,可能進一步影響其功能性質(zhì),這有待進一步的深入探討。