王永蓉，廉亞茹,，蔣國潤，范勝濤，馮敏，楊二霞，姜莉，董承紅，趙志梅，王麗春，廖蕓，張瑩，李琦涵

1. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南省傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118； 2. 艾美康淮生物制藥(江蘇)有限公司，泰州 225300

柯薩奇病毒A16型(coxsakievirus A16，CA16)作為腸道病毒家族成員之一[1]，與腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)類似，是引起兒童手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體[2-3]，這兩種病毒引起的HFMD病例達總病例的80%[4-5]。雖然EV71滅活疫苗已大規(guī)模推廣應用[6]，但其對CA16無交叉保護作用，因此CA16很可能成為今后兒童HFMD的主要病原[7]，針對CA16的疫苗研究具有十分重要的意義[8]。

近年來，隨著相關研究工作的推進，CA16疫苗研究已在多種技術層面取得進步[9-10]，但CA16感染病理學及相關免疫學基礎尚不清楚，迄今尚未取得實質性進展。本課題組前期有關CA16滅活疫苗的非人靈長類實驗結果提示，CA16滅活疫苗以常規(guī)模式難以獲得良好的有效免疫反應，尤其是在病毒攻擊時未能表現(xiàn)出有效的臨床保護效果[11]。盡管這一動物模型結果尚不能完全模擬CA16在人體內的感染與免疫過程，但深入探討其免疫學機制十分必要。

大量人群流行病學和臨床觀察及本課題組前期動物模型實驗結果提示，CA16和EV71均可通過呼吸系統(tǒng)導致感染[12-14]。呼吸道上皮組織作為具有天然免疫功能的器官，在機體抗病毒感染免疫反應的激活中發(fā)揮著重要作用[15-16]。近期受到人們關注的天然淋巴細胞(innate lymphoid cell，ILC)則是完成這一作用的主要成分之一[17]。ILC分為3個型別：ILC1、ILC及 ILC3。它們可由多種信號通路分子活化，包括表達于上皮細胞表面的干擾素(interferon，IFN)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)家族信號通路分子。受到病毒刺激時，ILC表面與這些信號分子結合的受體表達量會增加，以調節(jié)或整合天然免疫與適應性免疫，甚至非特異炎癥效應[18-19]。盡管ILC在機體抵抗病原體入侵免疫應答中的作用尚未完全清楚，但ILC缺失小鼠在病原體感染時不能提供有效的免疫保護，表明其在機體抵抗病原體的免疫反應中發(fā)揮關鍵作用[20-22]。

本研究利用組織培養(yǎng)體系和BALB/c小鼠模型，初步分析CA16抗原與ILC的相互關系及由此形成的機體特異性免疫反應的特點，為進一步探索基于病毒感染模型而設計相應疫苗免疫模式的可能提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1毒株及細胞CA16-G20株病毒從中國廣西壯族自治區(qū)全州縣的HFMD患兒咽拭子中分離，并經中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所培養(yǎng)、純化及保存[11]。增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)標記的CA16(EGFP-CA16)由本實驗室構建并保存。小鼠氣管上皮細胞CP-M175購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2主要試劑及設備TriZol試劑、DAB試劑購自天根生化科技(北京)有限公司，One-Step PrimeScript RT-PCR Kit購自日本TaKaRa公司，CA16抗體、細胞特異性表面標記KLRG1和CD11c、白細胞介素13(interleukin 13，IL-13)、TNF-α、IFN-γ、特異性熒光二抗等購自英國Abcam公司，GATA-3購自美國Santa Cruz公司，NKP46購自BioLegend 公司，視黃酸相關孤兒受體γt(retinoid-related orphan receptor γt，RORγt)、 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自美國BD公司，Areg、白細胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)購自美國R&D Systems公司，IL-22購自美國Novus公司，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、蘇木素購自美國Sigma公司，淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司，小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)試劑盒購自美國Mabtech公司。實驗使用的主要儀器為實時定量PCR儀(CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System；Bio-Rad，美國)、冷凍切片機(Thermo，美國)、TCS SP8熒光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)和C.T.L酶聯(lián)免疫斑點讀板機(Cellular Technology Limited，美國)。

1.1.3實驗動物實驗用BALB/c小鼠購于北京維通利華生物公司。動物實驗方案均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所動物倫理委員會審核通過，飼養(yǎng)管理等均符合動物福利要求。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)Vero細胞由含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，16HBE細胞由含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，CP-M175細胞培養(yǎng)在特別配制的完全培養(yǎng)基(CM-M175)中。

1.2.2CA16滅活抗原的制備與疫苗配方抗原滅活、純化方法如文獻所述[23]，然后按兩種方式進行實驗用疫苗的制備：①病毒抗原(400 EU/1.0 mL)與Al(OH)3佐劑(1 mg/mL)混合制備；②病毒抗原(400 EU/1.0 mL)與一種緩沖液(含1%角鯊烯、3%丙三醇和5%蔗糖)混合配制。

1.2.3病毒純化采用噬斑純化法對病毒進行純化。將病毒樣本連續(xù)10倍稀釋，取不同稀釋度的病毒液接種于細胞，于37 ℃孵育1 h，移去上清液，每孔加入含1×DMEM、3% FBS及1%瓊脂的混合試劑，于37 ℃孵育7 d，以多聚甲醛固定，0.1% 結晶紫染色[24]。

1.2.4定量反轉錄-聚合酶鏈反應(quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction，qRT-PCR) 利用TriZol試劑對樣品RNA進行抽提。qRT-PCR按One-Step PrimeScript RT-PCR 試劑盒說明操作，特異性引物序列詳見表1。在CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System儀上進行擴增，條件為42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，Tm 30 s，40個循環(huán)。以相對定量法計算各信號分子的表達量，內參基因為GAPDH，采用2-ΔΔCt法計算。

表1PCR引物序列

Tab.1SequencesofprimersforPCR

GeneSequence (5' to 3')H-4-1BBL-FACTCCTGGACTTAGACGATH-4-1BBL-RGCTGGCACATTACAGATGH-BTLA-FCAAGTTGGAAGGAAGAGAAGAH-BTLA-RGCAGAACAGCGGTATGACH-CD160-FGGATAGATGGTGTTGGTGAAH-CD160-RCCTGACTTCTGGCTTCTGH-GITRL-FCAATTAGAGACTGCTAAGGAGH-GITRL-RAGGTTCAGAAGATGCCATTH-IKKα-FATACAGCGAGCAGATGACH-IKKα-RCAACCTCAGCATAGTGGATH-IKKβ-FCATTGTTGTTAGCGAAGACTH-IKKβ-RGCCAGGACACTGTTAAGATH-LIGHT-FTCTTGCTGTTGTTCATTGCH-LIGHT-RCCTTCTTGGATGCTTCATTCH-LTα3-FGATGTCTGTCTGGCTGAGH-LTα3-RCCTGCTCTTCCTCTGTGTH-NIK-FCCGAGAAGAAGTCCACTGH-NIK-RGTCTGCTTGTCCTCCATCH-OX40L-FATGAGTCAAGGAGTGTAACCH-OX40L-RATGGCTGAGGAAGATGTAAGH-RANKL-FGGAGGAAGCACCAAGTATTH-RANKL-RCCTCTCCAGACCGTAACTH-TAK-FCCAACCAGAGTCGCAATCH-TAK-RGCAAGTCACATAGCAGAAGAH-TLIA-FAAGCCAGACTCCATCACTH-TLIA-RTACCTACTTCGCATACAGAC

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

1.2.5小鼠實驗分組及免疫體外實驗：鼻腔途徑免疫4周齡小鼠(100 EU/只)。免疫后第1、2、3天分別處死小鼠，采集口、鼻、肺組織，進行RNA提取和組織切片，用于qRT-PCR、免疫組織化學和免疫熒光檢測。體內實驗：將4周齡小鼠分為A、B、C、D四個組，進行兩次免疫(每次100 EU/只)，間隔28 d。A組兩次免疫均采用肌內注射；B組初次免疫采用肌內注射，加強免疫采用鼻腔途徑；C組采用鼻腔途徑僅進行一次免疫；D組兩次免疫均采用鼻腔途徑。于免疫前，一次免疫后14、28 d，二次免疫后7、14、28 d分別采血，分離血清，進行中和抗體測定。另外，于初次免疫后第28天和加強免疫后第1、3、5天分別處死小鼠，取脾臟，分離淋巴細胞，進行ELISPOT實驗。于全程免疫后第56天，對免疫組的雌鼠與非免疫組的正常雄鼠交配產下的乳鼠(24 h內)以顱內注射CA16(2×104CCID50/只)方式攻擊，每日觀察乳鼠活動、進食情況及生存率。

(1)為保持開挖后基巖的完整性和開挖面的平整度，對巖質基礎、邊坡、馬道的所有輪廓線上的垂直、斜坡面必須采用控制爆破。

1.2.6共聚焦顯微鏡檢測利用冷凍切片機將保存于液氮中的組織樣品切成薄片，丙酮固定，然后進行抗原封閉(5% BSA溶液)，孵育特異性一抗，清洗，再孵育熒光標記的二抗，清洗，滴加DAPI，用熒光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7免疫組織化學檢測組織切片用丙酮固定，置于3% H2O2中去除內源性過氧化物酶，然后以5% BSA封閉，隨后分別孵育特異性一抗和相應二抗，清洗，滴加DAB，以蘇木素復染，置于顯微鏡下觀察。

1.2.8中和抗體檢測按標準試驗方案倍比稀釋血清樣本，用于中和抗體檢測[23]。將不同稀釋度的血清與病毒液(每孔300 CCID50/100 μL)于37 ℃孵育1 h，加入Vero細胞，37 ℃培養(yǎng)7 d，每日觀察細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)。

1.2.9ELISPOT實驗采用淋巴細胞分離液，從小鼠脾臟中分離淋巴細胞。按IFN-γ ELISPOT試劑盒說明書操作，加入純化的CA16滅活抗原(20 EU/孔)刺激，利用酶聯(lián)免疫斑點讀板機檢測分泌IFN-γ的淋巴細胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用兩獨立樣本均數(shù)t檢驗比較基因相對表達量，生存率采用log-rank法分析，P<0.05 為差異有顯著意義。

2 結果

2.1 CA16感染16HBE后上調ILC激活相關信號分子的表達

本課題組前期研究證實，CA16可感染包括呼吸道上皮細胞在內的人類多種細胞[25-26]。本研究用CA16感染體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細胞16HBE，感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為 0.1～0.2 時，CA16可引起16HBE細胞發(fā)生病變(圖1A)，伴隨細胞逐漸腫脹變圓及從培養(yǎng)瓶底部脫落這一過程的是病毒動力學增殖過程(圖1B)。呼吸道上皮細胞表面表達多種受體，如模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)、病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)和能激活免疫細胞的信號分子[27-28]。通過這些受體行使功能，呼吸道上皮細胞在天然免疫中發(fā)揮著十分重要的作用。用CA16(MOI=1)感染人支氣管上皮細胞后，檢測上皮細胞表達的ILC激活相關重要信號分子的轉錄水平，包括IFN和TNF家族。結果顯示，在CA16感染早期，16HBE細胞就上調了針對ILC活化的信號分子表達，包括TNF-α、RANKL、GITRL、LIGHT。相較之下，IFN-α上調程度較低，而IFN-λ表達水平明顯上升(圖1C)。結果提示， CA16感染氣管內具有重要天然免疫啟動作用的上皮細胞的過程實際上是一個上調組織內激活天然免疫系統(tǒng)信號分子的階段。

A: Typical cytopathic effects of 16HBE cells during CA16 infection. The sample was obtained at 8, 16, 24, 32 and 48 h after CA16 infection. B: Viral dynamic proliferation in 16HBE cells. C: Expression of signaling molecules that activate ILCs in CA16-infected 16HBE cells. The sample was obtained at 8, 16 and 24 h after CA16 infection. The results were normalized to the level of endogenous GAPDH. The y-axis indicates the relative quantity of specific mRNA in the samples compared with the same gene in the control group (uninfected cells, y=1). Error bars indicate the SEM of the relative quantities.*P<0.05.

圖1CA16感染人氣管上皮細胞16HBE的生物學特性

Fig.1BiologicalanalysisofCA16infectioninhumantrachealepithelial16HBEcells

2.2 CA16抗原導入CP-M175后上調ILC激活相關信號分子的表達

進一步探討CA16抗原或滅活的CA16是否也能模擬活病毒對ILC的激活起刺激作用，從而為后續(xù)能在動物模型中揭示其誘導免疫反應機制提供一定的基礎。然而，成年小鼠體內缺乏CA16受體而對CA16不易感，因此采用特別配制的類脂性試劑與CA16滅活病毒制備實驗用疫苗，研究CA16抗原與小鼠氣管上皮細胞系CP-M175的相互作用。

A: Transduction efficiency of CA16 antigen in CP-M175 cells. The fluorescence intensity was scanned by gray-scale software. The sample was obtained at 8, 16 and 24 h after CA16 infection. B: Expression of signaling molecules that activate ILCs in CA16-infected CP-M175 cells. The sample was obtained at 8, 16 and 24 h after CA16 infection. The results were normalized to the level of endogenous GAPDH. The y-axis indicates the relative quantity of the specific mRNA in the samples compared with the same gene in the control group [cells treated with specific buffer (containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose) but without viral antigen, y=1]. Error bars indicate the SEM of the relative quantities.*P<0.05.

圖2滅活的CA16顆粒內化到小鼠呼吸道CP-M175細胞中上調ILC激活相關信號分子的表達

Fig.2InactivatedCA16virusparticlesinternalizedintomouseepithelialCP-M175cellsupregulatesignalingmoleculesforILCactivation

2.3 CA16抗原在呼吸道上皮組織中的分布及相關信號分子表達

上皮細胞可通過分泌功能分子與免疫細胞相互作用來調節(jié)天然免疫和適應性免疫[29]。為進一步研究CA16抗原與ILC的相互作用，采用特別配制的CA16滅活實驗疫苗通過鼻腔途徑免疫BALB/c小鼠，以模擬病毒在自然情況下的感染。于免疫后第1、2、3天，分別處死小鼠，檢測呼吸道組織包括鼻腔、口腔和肺組織病毒抗原分布及對ILC有激活作用的信號通路分子的表達量。結果顯示，抗原經鼻腔免疫后3 d內，呼吸道黏膜組織中可觀察到CA16抗原廣泛分布(圖3A)。此外，對ILC有激活作用的多種信號通路分子mRNA均出現(xiàn)明顯上調，包括TNF-α、RANKL、CD160、LIGHT及GITRL(圖3B)。這與CA16感染人上皮細胞時出現(xiàn)的ILC激活相關信號分子表達趨勢類似。這些基因高表達區(qū)域主要集中于上呼吸道，特別是口腔和鼻腔組織；而肺組織中只有TNF-α出現(xiàn)較高表達(圖3B)。此外，還檢測了各類ILC活化后分泌的細胞因子表達水平(圖3C)?？谇缓捅乔唤M織中ILC分泌的各種細胞因子基因表達趨勢類似，但鼻腔組織中的表達水平高于口腔；肺組織中僅IL-22、IL-25、IL-1β及Areg表達升高。結果表明，CA16抗原內化到呼吸道黏膜上皮細胞后，能被上皮細胞表面的PRR識別并上調ILC激活相關信號通路分子的表達，同時ILC分泌的各類細胞因子mRNA表達量明顯升高。

2.4 CA16抗原進入呼吸道黏膜組織后與ILC及樹突細胞(dendritic cell，DC)的相互關系

CA16抗原通過鼻腔途徑免疫以模擬病毒自然感染途徑從而激活機體的抗病毒免疫是筆者提出的一個假說，本研究的核心即揭示CA16抗原與天然免疫的相互關系?；诳乖庖咝∈蠛粑鲤つそM織中高水平的ILC激活相關信號通路分子表達，進一步檢測病毒抗原與天然免疫系統(tǒng)，尤其是其與ILC和DC的相互作用。對3類具有不同特征分子的ILC[30]與CA16抗原的共定位觀察表明，以GATA-3和NKp46為特征分子的ILC1在鼻腔黏膜組織中與CA16抗原共定位。與ILC1類似，在以GATA-3和RORγt為特征分子的ILC3中也觀察到CA16抗原的存在(圖4A)。但這種與CA16抗體共定位的關系并未在以GATA-3和KLRG-1為特征分子的 ILC2中觀察到。與此同時，采用免疫組織化學方法檢測ILC活化后分泌的細胞因子發(fā)現(xiàn)，伴隨CA16抗原出現(xiàn)，部分細胞因子如Areg、IL-1β、IL-13、IL-12、TNF-α及IFN-γ分泌增加(圖4B)。結果提示，CA16抗原進入呼吸道黏膜組織后，明顯激活了ILC系統(tǒng)。此外，還觀察到CD11c+DC與CA16抗原有共定位關系(圖4C)。

2.5 CA16抗原經鼻腔免疫后在小鼠體內誘導的免疫反應

上述實驗結果表明，特殊佐劑介導的CA16滅活抗原經鼻腔途徑免疫可有效激活呼吸道組織中的ILC等天然免疫系統(tǒng)。據(jù)此提出疑問：ILC的免疫應答是否能引起特異性的抗病毒免疫應答從而保護機體？因此，進一步比較4種免疫方式的小鼠體內中和抗體和細胞免疫反應指標。結果顯示，單純的一次或兩次鼻腔免疫均可誘導小鼠抗CA16的血清中和抗體，但顯然僅進行一次免疫誘導的抗體效價較低，幾何平均效價(geometric mean titer，GMT)僅為 1∶8 左右；而采用兩次免疫可在第二次免疫4周后誘導出相對較高的中和抗體，GMT達 1∶16。兩次肌內注射免疫可誘導更高的中和抗體，GMT達1∶64左右。然而，采用一次肌內注射免疫和一次鼻腔加強免疫的小鼠中，GMT達1∶128～1∶256(圖5A)。同時，比較各組免疫小鼠脾淋巴細胞的IFN-γ特異性ELISPOT反應，結果表明抗原刺激后，各組小鼠均出現(xiàn)了明顯的特異性IFN-γ反應細胞增殖(圖5B)。在進一步的保護性實驗中，采用不同方式免疫的雌鼠所產下的乳鼠受到病毒攻擊時，顯現(xiàn)出了不同生存率，其中以肌內注射首次免疫加鼻腔加強免疫的保護率最高，為100%(圖5C)。乳鼠受病毒攻擊后也表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，對照組所有乳鼠均出現(xiàn)四肢消瘦、麻痹的現(xiàn)象，其中 22.2% 死亡；而免疫組小鼠出現(xiàn)明顯臨床癥狀的比例相對較低(表2)。綜上表明，CA16抗原通過與ILC相互作用啟動了有效的抗病毒免疫反應。

A: Distribution of CA16 antigens in respiratory tract tissues. Samples from mouth, nose and lung tissues were obtained at 1, 2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization. B: Expression of signaling molecules that activate ILCs in respiratory tract tissues harvested from CA16-immunized mice. Mouth, nose and lung tissue samples were obtained at 1,2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization. The results were normalized to the level of endogenous GAPDH. The y-axis indicates the relative quantity of the specific mRNA in the samples compared with the same gene in the control group (immunized with specific buffer containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose but without viral antigen, y=1). Error bars indicate the SEM of the relative quantities.*P<0.05. C: Expression of cytokines that were secreted by ILCs in respiratory tract tissues harvested from CA16-immunized mice. Mouth, nose and lung tissue samples were obtained at 1, 2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization. The results were normalized to the level of endogenous GAPDH. The y-axis indicates the relative quantity of the specific mRNA in the samples compared with the same gene in the control group [immunized with specific buffer (containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose) but without viral antigen, y=1]. Error bars indicate the SEM of the relative quantities.*P<0.05.

圖3CA16抗原在呼吸道組織中分布且上調ILC激活相關信號分子的表達

Fig.3CA16antigendistributedinrespiratorytracttissuesupregulatessignalingmoleculesforILCactivation

A: Confocal fluorescence microscopy of CA16 antigen and ILC1/ILC3 in respiratory mucosal tissues from CA16-immunized mice. Nose tissue samples were obtained at 2 d after inactivated CA16 vaccine immunization. B: Expression of immune molecules secreted by activated ILCs in respiratory tract tissues from CA16-immunized mice. Nose, mouth and lung tissue samples were obtained at 1, 2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization. Mice were immunized with specific buffer (containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose) but without viral antigen in the control group. C: Confocal fluorescence microscopy of CA16 antigen and DCs in respiratory mucosal tissues from CA16-immunized mice. Nose, mouth and lung tissue samples were obtained at 1, 2 and 3 d after inactivated CA16 vaccine immunization.

圖4CA16抗原與ILC和DC在呼吸道黏膜組織中的相互作用

Fig.4InterrelationshipsofCA16antigenwithILCsandDCsinrespiratorymucosaltissues

表2顱內注射病毒后乳鼠臨床癥狀的比較

Tab.2Comparisonofclinicalsymptomsofneonatalratswithintracranialinjectionofvirus

臨床癥狀對照組兩次肌內注射免疫組一次肌內注射免疫+一次鼻腔免疫組兩次鼻腔免疫組一次鼻腔免疫組四肢消瘦、麻痹100%0011.1%16.7%死亡22.2%0011.1%16.7%

A: Neutralizing antibody titers induced by the inactivated CA16 vaccine via different routes in mice. The samples were obtained within 56 d after inactivated CA16 vaccine immunization (arrow). B: IFN-γ-specific immune responses induced by the inactivated CA16 vaccine via different routes in mice. The samples were obtained within 28 d after booster immunization. C: Protective effects of the inactivated CA16 vaccine administered to mice via different routes. The immunized mice were challenged with CA16 on day 0. The survival rates were analyzed within 14 d of CA16 infection. Mice were immunized with specific buffer (containing 1% squalene, 3% glycerol, 5% sucrose) but without viral antigen in the control group. ns, not significant.

圖5CA16抗原經小鼠鼻腔免疫后特異性抗CA16的免疫反應評價

Fig.5EvaluationofspecificimmuneresponsesagainstCA16inmiceimmunizedvianasalroute

3 討論

眾所周知，ILC是一群具有免疫功能的細胞，在天然免疫和適應性免疫應答之間建立聯(lián)系[31]。其活化依賴一些上皮黏膜組織細胞表達的信號通路分子[32]，大部分為IFN或TNF-α家族成員，通過與ILC表面的受體結合而發(fā)揮作用[33]。許多病毒通過呼吸道上皮細胞、胃腸道及尿道甚至皮膚感染機體，在這種情況下，誘導抗病毒免疫與ILC激活可能存在直接關聯(lián)[34]。從這個意義上講，如果病毒疫苗能模擬病毒感染路徑，則其誘導有效抗病毒免疫反應的可能性大大提高。

本課題組前期關于EV71和CA16感染機制的研究發(fā)現(xiàn)，這兩個病毒均可通過呼吸道傳播而感染靈長類動物。因此，本研究首先以人氣管上皮細胞16HBE細胞為模型，用CA16進行體外感染并檢測ILC激活相關信號通路分子的表達。結果顯示，16HBE被CA16感染時，細胞中IFN、TNF家族包括IFN-λ、TNF-α、RANKL、GITRL、LIGHT等表達上調。這些信號通路分子通過與ILC表面的受體結合而促進ILC的激活[35]。然后，以特殊介質介導CA16抗原進入小鼠呼吸道上皮細胞，觀察細胞內天然免疫信號分子的表達變化。結果表明，以IFN、TNF家族為中心的信號分子表達趨勢與CA16感染人氣管上皮細胞類似，即細胞中ILC激活相關因子表達水平明顯上升。其后，將這種特別配制的CA16滅活抗原通過鼻腔途徑免疫小鼠，檢測ILC激活相關信號分子的轉錄水平。結果顯示，呼吸道組織包括鼻腔、口腔及肺組織中ILC激活相關因子表達水平上調。結果表明，這種新的免疫方式確實能模仿病毒感染途徑，且在感染初期能調節(jié)天然免疫系統(tǒng)。同時，對免疫后小鼠的口腔、鼻腔及肺組織進行免疫熒光檢測，證明CA16抗原在組織中分別能與ILC1、ILC3及CD11c+DC共定位。對這些組織進行免疫組織化學分析，觀察到活化的ILC分泌的細胞因子表達上升，也為以上推論提供了支持。以上這些結果為病毒抗原如何與天然免疫系統(tǒng)相互作用及接種疫苗后早期階段的最初免疫應答提供了新的理解。此外，還檢測了采用不同方式免疫的小鼠體內抗CA16中和抗體和特異性免疫應答，結果為“CA16抗原與ILC之間的相互作用是誘導抗病毒免疫的起始”這一假設提供了證據(jù)。

綜上所述，CA16疫苗的研究進展緩慢，表明人們對這類病毒感染過程及其相關免疫學反應尚缺乏足夠認識?；谌藗儗μ烊幻庖呦到y(tǒng)尤其是ILC認識的逐漸深入，本研究從CA16抗原與天然免疫反應之間的相互關系方面探討了CA16疫苗研究的一個可能途徑。目前，盡管很多研究認為CA16疫苗研發(fā)需較好的免疫策略及劑型，但本研究所得結果可能會加深人們對病毒抗原如何激活免疫系統(tǒng)的認識，為今后疫苗研發(fā)提供新的思路。