俞慧菊，張慧英，付卓敏，張曉玲，宋志剛，易志剛

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院，上海 200092； 2. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心病原體檢測和生物安全部，上海 201508； 3. 上海師范大學第二附屬中學，上海 200540； 4. 復旦大學基礎醫(yī)學院病原生物系，醫(yī)學分子病毒學教育部/衛(wèi)生部重點實驗室，上海 200032

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是威脅5歲以下嬰幼兒健康的重要傳染病，一般癥狀較輕，但重癥患者可表現(xiàn)為無菌性腦炎、腦膜腦炎、弛緩性麻痹和肺水腫等，甚至出現(xiàn)死亡[1]。近年來，手足口病在國內(nèi)各地有暴發(fā)流行，成為嚴重威脅我國兒童健康的重要疾病。2008年，我國安徽阜陽暴發(fā)了大規(guī)模的手足口病疫情，死亡病例達128例，病死率為 2.5/10 000[2]。因此，自2008年起國家衛(wèi)生部將手足口病納入丙類傳染病管理。

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是重癥手足口病的主要病原體，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘導神經(jīng)源性肺水腫，但發(fā)病機制尚不清楚。在感染性疾病進程中患者出現(xiàn)細胞因子風暴較常見，這往往是導致病情加重和死亡的重要原因。EV71感染的疾病進程與機體免疫反應異常密切相關，重癥手足口病患者血清中的細胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-10 、IL-1β、IL-13水平較高，而宿主的強炎癥反應是病情惡化的重要原因[3-5]。有研究表明，雌二醇對細胞因子有明顯抑制作用，但針對重癥手足口病患者中的細胞因子變化，其血清中的雌二醇與輕癥患者相比是否存在差異，雌二醇水平與疾病嚴重程度是否相關，至今未見報道。為此，本研究收集了2010—2017年上海部分地區(qū)手足口病病例，采集鼻咽拭子、糞便、皰疹液和血液標本，通過分子生物學方法鑒定病原種類，利用免疫學技術檢測血清雌二醇和細胞因子水平，探尋重癥手足口病患者中雌二醇水平與細胞因子水平的關系，為手足口病的預防和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究所選病例為 2010—2017年期間上海市公共衛(wèi)生臨床中心、上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院住院的手足口病患兒，共43例，參照《手足口病診療指南(2018版)》的診斷標準重新分組。12例入重癥組，其中男性10例，女性2例，平均年齡(3.67±2.18歲)；31例入輕癥組，其中男性15例，女性16例，平均年齡(3.2±1.52)歲。另有23例正常體檢兒童列入對照組，其中男性13例，女性10例，平均年齡(2.14±1.57)歲。

1.2 研究方法

1.2.1EV71檢測按Qiagen RNA Mini Kit試劑盒操作步驟，提取鼻咽拭子、糞便和皰疹液等樣本RNA，純化的核酸于 -80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。采用TaKaRa公司One Step Realtime RT-PCR試劑盒，進行EV71核酸檢測。

1.2.2雌二醇定量檢測利用化學發(fā)光免疫技術對血清和血漿中的雌二醇進行定量檢測，參照雅培公司ARCHITECT I2000分析系統(tǒng)和專用試劑。

1.2.3細胞因子檢測采用Milliplex 多因子(xMAP)檢測技術對人血漿或血清中的IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)等細胞因子進行定量測定。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 手足口病的臨床特征

43份手足口病標本中，EV71核酸均陽性，重癥組和輕癥組的人群特征、臨床特征分析詳見表1?？ǚ綑z驗顯示，四肢皮疹和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀在重癥患者中出現(xiàn)的頻率更高，分別占 66.7%(P=0.018)和 33.3%(P=0.005)，與輕癥組相比差異有統(tǒng)計學意義。兩組之間其他人群特征和臨床特征無統(tǒng)計學差異。

表1手足口病患兒的人群和臨床特征

Tab.1DemographicandclinicalcharacteristicsofHFMDcases

重癥組(n=12)輕癥組(n=31)P值年齡(歲)(x±s)3.67±2.183.2±1.520.427男性(n,%)10(83.3)15(48.4)0.082女性(n,%)2(16.7)16(51.6)0.082體溫(℃)(x±s)39.4±0.539.1±0.60.133皮疹部位 手(n,%)12(100)30(96.8)0.618 足(n,%)12(100)24(77.4)0.181 口(n,%)12(100)26(83.9)0.343 臀部(n,%)10(83.3)15(48.4)0.082 四肢(n,%)8(66.7)7(22.6)0.018其他癥狀 呼吸系統(tǒng)癥狀(n,%)2(16.7)4(12.9)0.696 神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(n,%)4(33.3)0(0)0.005

2.2 血清細胞因子變化與手足口病病情的相關性

檢測手足口病患者血清細胞因子水平，結果顯示，重癥組血清中IFN-γ、IL-8和IL-6水平均顯著高于輕癥組(P<0.01)，但IL-1β、IL-4和IL-17水平差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。男性與女性患者之間血清IL-1β、IL-17、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-8這6個細胞因子水平差異無統(tǒng)計學意義。結果表明，血清IFN-γ、IL-8和IL-6這3個細胞因子水平與手足口病病情嚴重性相關，特別是重癥患者的IL-8水平比輕癥患者高26倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1手足口病重癥組與輕癥組血清細胞因子水平的比較

Fig.1ComparisonofserumcytokinesbetweensevereHFMDgroupandmildHFMDgroup

2.3 血清雌二醇變化與手足口病病情的相關性

檢測手足口病患者血清雌二醇水平，結果顯示，重癥組、輕癥組、健康對照組的雌二醇水平分別為(6.12±6.08)pg/mL、(30.2±10.16)pg/mL、(20.62±7.43)pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。男性和女性患者的血清雌二醇水平分別為(15.84±12.27)pg/mL、(30.33±14.26 pg/mL)，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.125)。

2.4 細胞因子水平與雌二醇水平的相關性

血清IL-6和IL-8水平與雌激素水平有較高的相關性(Spearmen相關系數(shù)IL-6：r=-0.890 1，P=0.003 1；IL-8：r=-0.811 3，P=0.014 5)(表2)。IL-8和IL-6水平與血清雌二醇水平呈負相關，提示雌激素與炎癥免疫反應密切相關。然而，細胞因子INF-γ、IL-17、IL-1β和IL-4水平與雌二醇水平無相關性。

表2手足口病患兒血清雌二醇水平與細胞因子水平的相關性分析

Tab.2CorrelationbetweenserumestradiolandcytokinesinHFMDpatients

細胞因子r值R2值P值IFN-γ-0.131 80.017 370.735 4IL-17-0.271 40.073 680.479 9IL-1β-0.322 10.103 80.397 9IL-4-0.084 50.007 140.828 9IL-6-0.890 10.792 20.003 1IL-8-0.811 30.658 10.014 5

3 討論

手足口病是腸道病毒感染引起的一種兒童常見傳染病，病原體主要血清型包括柯薩奇病毒A型和B型、?？刹《?、新腸道病毒71型。近年來，EV71的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢，國內(nèi)各地全年均有暴發(fā)流行，發(fā)病率為 37.01/100 000～205.06/100 000，報告病死率為 6.46/100 000～51.00/100 000。手足口病的發(fā)病率和病死率位于丙類傳染病首位，已成為嚴重威脅我國5歲以下兒童健康的重要疾病。雖然目前國內(nèi)EV71疫苗已上市，但手足口病疫情并未得到有效控制，其他腸道病原體一直在持續(xù)流行，重癥和死亡病例也是目前手足口病的防治重點。

本研究發(fā)現(xiàn)，重癥手足口病患者中血清細胞因子水平顯著升高，在部分患者中甚至超過60 pg/mL，尤其是血清IFN-γ、IL-8和IL-6水平在重癥與輕癥患者之間有顯著性差異。Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，EV71 刺激后能增強細胞因子分泌，尤其是Th1 細胞分泌的相關因子(IFN-γ)和促炎因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-13)顯著升高。出現(xiàn)肺水腫等重癥癥狀時，這些細胞因子會有較大升高，血液中的IL-6含量會達到峰值，甚至超過70 pg/mL[4-5]。Huang等[6]報道，外源性IL-6、IL-13和IFN-γ能誘導EV71感染小鼠產(chǎn)生致死性肺水腫，而肺水腫也是臨床患者病情加重和病死的重要原因。因此，血清細胞因子水平與手足口病嚴重程度具有相關性。王艷春等[7]也報道，EV71感染者血清IL-6和IL-1β升高是危重癥的重要因素之一，可作為病情嚴重程度的生物標記。Khong等[5]體外實驗也證實，用IL-6抗體治療能有效降低EV71感染小動物的死亡率。免疫反應在EV71感染的疾病進程中起重要作用，但更深入的機制仍不清楚。此外，本研究中重癥患者血清IL-1β水平未出現(xiàn)顯著差異，與Wang等[3]報道不符，分析原因可能與檢測方法和試劑有關，也可能與宿主本身變化有關，需進一步驗證。

有研究[8]發(fā)現(xiàn)，雌二醇等性激素具有顯著免疫調(diào)節(jié)作用，可直接影響機體對微生物感染的免疫反應。本研究發(fā)現(xiàn)，手足口病患者中血清雌二醇水平與病情嚴重程度相關，還與IL-6和IL-8水平呈負相關，雌二醇水平越高，IL-6和IL-8水平越低，病情越輕。有學者[9]認為，雌激素可通過下丘腦-垂體-腎上腺軸的作用促進腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素，后者通過復雜的調(diào)節(jié)機制對包括 IL-1β、TNF-α 在內(nèi)的多種細胞因子產(chǎn)生抑制作用。例如，IL-6同時具有促炎癥和抗炎癥作用，在抵抗微生物感染過程中起重要作用[10-11]，而雌二醇、孕酮等雌激素能通過抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號通路來調(diào)節(jié)機體單核-巨噬細胞中的IL-6表達。Ghazeeri等[12]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素能調(diào)節(jié)人巨噬細胞中CD16的表達量，從而影響單核細胞和巨噬細胞分泌 IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞因子。同時，雌激素對細胞因子分泌存在濃度依賴性，在高水平雌激素條件下，雌激素抑制巨噬細胞、造骨細胞和骨髓細胞等分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞因子[8,10,13]。因此，雌二醇可能通過上述途徑來調(diào)節(jié)細胞因子分泌，從而造成手足口病疾病進程的差異。

國內(nèi)多地區(qū)手足口病流行病學資料顯示，手足口病患兒中男性比例高于女性，約為 1.5∶1。本研究顯示，12例重癥患兒中男女比為5∶1，而女性雌二醇水平比男性高，是否存在手足口病嚴重程度與雌激素水平相關的可能？但因病例數(shù)有限，差異無統(tǒng)計學意義，且未細分，不能得出兩者有相關性的結論，故需擴大研究范圍和增加病例數(shù)，以做進一步論證。

本研究發(fā)現(xiàn)，手足口病患者中血清雌二醇水平與細胞因子IFN-γ、IL-8和IL-6水平相關，這些指標的變化可能影響手足口病的預后。因此，將這些指標作為重癥手足口病臨床評估的生物標記，在急性期關注血清雌二醇、IL-8、IL-6的表達水平，可能有助于臨床判斷疾病嚴重程度和預測疾病演變情況，提早干預治療，從而為防治重癥并發(fā)癥提供依據(jù)。本研究僅在臨床上發(fā)現(xiàn)了雌二醇水平與細胞因子水平的關系，尚未能闡明雌二醇對細胞因子的調(diào)節(jié)信號通路和關鍵環(huán)節(jié)，因此雌二醇在手足口病疾病進程中的機制需進一步深入研究。