何 明，董 毅，劉玉蘭，王 燕

宮頸癌是一種臨床常見婦科惡性腫瘤，發(fā)病率僅低于乳腺癌，是婦科惡性腫瘤致死的主要原因，自宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查及人乳頭瘤病毒檢測技術(shù)應(yīng)用以來，大大提高了宮頸癌前病變及宮頸癌的早期診斷率，及時治療后，病死率得到了有效控制[1-2]。但隨著近年來社會結(jié)構(gòu)和人們生活方式的改變，宮頸癌的發(fā)病率呈年輕化趨勢，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的研究是目前臨床廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。TWIST蛋白是一種主要在胚胎中胚層及胎盤等組織中表達(dá)的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，胎兒出生后表達(dá)水平顯著降低，在誘導(dǎo)細(xì)胞分化及遷移中具有重要調(diào)控作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TWIST是一種在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)的原癌基因，與腫瘤細(xì)胞凋亡、血管生成及腫瘤抗藥性密切相關(guān)，同時還具有誘導(dǎo)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的作用，可將其作為惡性腫瘤預(yù)后及治療的新的靶點(diǎn)[3]。E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)是一種參與Ca2+依賴性細(xì)胞黏附生理過程的跨膜糖蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，上皮性腫瘤進(jìn)展過程中可觀察到不同程度的E-Cadherin丟失或功能抑制，且E-Cadherin可能與腫瘤分化及臨床分期具一定相關(guān)性[4]。目前，已在食管鱗癌、乳腺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)TWIST與E-Cadherin的異常表達(dá)[5-6]，然而關(guān)于其在宮頸癌中的研究鮮有報(bào)道。本研究通過檢測TWIST與E-Cadherin在宮頸癌中的表達(dá)水平，并結(jié)合宮頸癌臨床病理因素綜合分析，探究其表達(dá)水平的相關(guān)性及其在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年7月—2017年6月于我院行廣泛性全子宮切除聯(lián)合盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)治療宮頸癌患者的完整標(biāo)本74例作為宮頸癌組，年齡30～62(47.1±2.2)歲。①納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為宮頸癌；術(shù)前均未接受放療及化療。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、婦科嚴(yán)重感染性疾病及妊娠期患者；半年內(nèi)無子宮頸治療史及子宮內(nèi)膜異位病史。收集同期行Leep手術(shù)切除或陰道下活檢的完整宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)標(biāo)本35例作為CIN組，年齡35～63(49.2±3.1)歲；并收集同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)治療的正常宮頸組織22例作為正常宮頸組，年齡32～61(46.5±2.8歲)。3組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑與方法

1.2.1主要實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗人TWIST和E-Cadherin多克隆抗體購自北京博奧森生物有限公司，兔源性二抗和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2.2標(biāo)本處理：常規(guī)組織標(biāo)本取材后，石蠟固定，低溫-20℃保存冷凍10 min；連續(xù)切片4張，厚度為4 μm；置于烤箱中烘干后，將切片分別浸入二甲苯10 min，2次；無水乙醇2 min，2次；90%乙醇2 min，2次；80%乙醇2 min，2次；常規(guī)脫蠟至水化。使用3%過氧化氫孵育15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗3 min；PBS緩沖液沖洗5 min，3次。用微波爐行抗原修復(fù)后，高溫高壓160℃煮沸持續(xù)3 min，自然冷卻至室溫，滴加兔源性一抗，4℃冰箱中過夜；室溫下復(fù)溫，PBS沖洗5 min，3次；加兔源性二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次。應(yīng)用DAB顯色，顯色時間4 min；蘇木素復(fù)染1 min，自來水沖洗15 min；分別浸入80%乙醇5 min，90%乙醇5 min，無水乙醇5 min，無水乙醇10 min，二甲苯10 min，3次；依次浸泡脫水，切片風(fēng)干后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。以PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。

1.2.3結(jié)果判定：由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專家審查后做出統(tǒng)一的病理臨床診斷，在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃色或黃褐色染色即可判定為TWIST陽性，觀察到細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色染色即可判定為E-Cadherin陽性。根據(jù)光學(xué)顯微鏡下觀察到的染色強(qiáng)度將其分為陰性、弱陽性、中等陽性及強(qiáng)陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1TWIST的表達(dá)情況 TWIST主要表達(dá)在正常宮頸、CIN及宮頸癌組織的細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)觀察到少量表達(dá)。宮頸癌組TWIST的陽性表達(dá)率顯著高于正常宮頸組和CIN組(P<0.05)，正常宮頸組與CIN組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組不同類型宮頸組織中TWIST的表達(dá)情況(例)

2.2TWIST與臨床病理特征的關(guān)系 不同的年齡、組織類型、臨床分期、分化程度及腫瘤大小患者間宮頸癌組織TWIST的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。間質(zhì)浸潤深度≥1/2患者宮頸癌組織TWIST的陽性表達(dá)率顯著高于間質(zhì)浸潤深度<1/2的患者(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者宮頸癌組織TWIST的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。見表2。

表2 TWIST的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3E-Cadherin的表達(dá)情況 E-Cadherin主要表達(dá)在正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的細(xì)胞膜內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)可觀察到少量表達(dá)。宮頸癌組的E-Cadherin陽性表達(dá)率顯著低于正常宮頸組和CIN組(P<0.05)，正常宮頸組與CIN組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4E-Cadherin與臨床病理特征的關(guān)系 不同的年齡、組織類型、臨床分期、分化程度及腫瘤大小患者間宮頸癌組織E-Cadherin的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。間質(zhì)浸潤深度≥1/2患者的宮頸癌組織E-Cadherin陽性表達(dá)率顯著低于間質(zhì)浸潤深度<1/2的患者(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的宮頸癌組織E-Cadherin陽性表達(dá)率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。見表4。

2.5相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TWIST與E-Cadherin在宮頸癌組織中表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.511，P<0.001)。

表3 3組不同類型宮頸組織中E-鈣黏蛋白的表達(dá)情況(例)

3 討論

細(xì)胞凋亡是基因控制細(xì)胞自助死亡的主動生理過程，涉及多種基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等方面。而細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡失衡是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)病的主要原因，亦是惡性腫瘤的基本特征[7]。多項(xiàng)臨床研究認(rèn)為，TWIST是一種具有編碼抗凋亡蛋白及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡作用的原癌基因，其表達(dá)升高可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險增加[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TWIST的表達(dá)在正常宮頸及CIN組織主要為陰性及弱陽性，在宮頸癌組織中主要為中度陽性及強(qiáng)陽性，且TWIST在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常宮頸和CIN組織，正常宮頸與CIN組織中的陽性表達(dá)率比較無差異。其原因可能為CIN雖具有較高的惡性轉(zhuǎn)化可能，但仍處于癌前病變階段，同時可能受本研究樣本量較少影響。提示TWIST可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

表4 E-鈣黏蛋白的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

本研究結(jié)果還顯示，TWIST的陽性表達(dá)率不受患者年齡、組織類型、臨床分期、分化程度及腫瘤大小影響，而受宮頸癌間質(zhì)浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響。浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤臨床治療工作中的難點(diǎn)問題，也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，是受多種因素共同影響的復(fù)雜生物學(xué)進(jìn)程。方雪妮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，TWIST能促進(jìn)侵入性偽足高表達(dá)，使其降解細(xì)胞外基質(zhì)，幫助腫瘤細(xì)胞侵入周圍組織。還有研究發(fā)現(xiàn)，TWIST能促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，促進(jìn)新生血管生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移[10]。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TWIST的表達(dá)還與宮頸癌的預(yù)后相關(guān)。由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者預(yù)后不良的主要原因，提示可將TWIST的陽性表達(dá)率作為評價宮頸癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)，但本研究中尚未進(jìn)行生存率方面的比較分析，有待進(jìn)一步深入探究。

E-Cadherin是一種單次跨膜鈣依賴性糖蛋白，具有維持上皮細(xì)胞完整性的作用。當(dāng)E-Cadherin丟失或功能被抑制時，可導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力降低，增加浸潤轉(zhuǎn)移風(fēng)險。有研究認(rèn)為，E-Cadherin是一種腫瘤抑制蛋白，其表達(dá)降低與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E-Cadherin在正常宮頸及CIN組織中的表達(dá)主要為中度陽性及強(qiáng)陽性，在宮頸癌組織中的表達(dá)主要為陰性及弱陽性，且TWIST在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著低于正常宮頸和CIN組織，正常宮頸與CIN組織的陽性表達(dá)率比較無差異。其原因可能為CIN屬于低級別的上皮內(nèi)瘤變，且大多數(shù)患者病情可自行消退恢復(fù)正常，不屬于腫瘤性病變[15]。提示E-Cadherin表達(dá)水平降低可能具有促進(jìn)宮頸癌發(fā)生的作用。

本研究結(jié)果還顯示，E-Cadherin在宮頸癌中的陽性表達(dá)率不受患者年齡、組織類型、臨床分期、分化程度及腫瘤大小影響，而受宮頸癌間質(zhì)浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，提示E-Cadherin表達(dá)水平降低可能具有促進(jìn)宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的作用。分析其作用機(jī)制可能為，上皮是由極化的上皮細(xì)胞通過E-Cadherin、α-Cadherin、β-Cadherin、γ-Cadherin作用緊密連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架上形成極為牢固的結(jié)構(gòu)，E-Cadherin表達(dá)水平降低可導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力降低，連接松散，失去上皮形態(tài)及極性，成為間質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞表型，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，TWIST與E-Cadherin在宮頸癌組織中表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示TWIST與E-Cadherin在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中二者相互影響，可能具有拮抗作用。張琦等[16]等研究發(fā)現(xiàn)，TWIST可作用于E-Cadherin啟動因子上的E-boxes序列，抑制E-Cadherin的表達(dá)，從而降低細(xì)胞黏附率，促進(jìn)惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。結(jié)果與本研究相似。

綜上所述，TWIST在宮頸癌組織中表達(dá)水平升高，且與間質(zhì)浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能具有促進(jìn)宮頸癌發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移的作用，作用機(jī)制可能與TWIST抑制E-Cadherin的表達(dá)相關(guān)。本研究仍存在不足之處，如未進(jìn)行TWIST與E-Cadherin表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后生存率的分析，有待進(jìn)一步隨訪。