何 蕾，馬慧萍，景臨林，張冬梅，賈正平

高原地區(qū)由于空氣稀薄，易造成初入高原人群身體不適。其中生理變化包括血氧飽和度下降，紅細(xì)胞增多，血液黏稠度增加，血液流變學(xué)改變，進(jìn)而影響全身組織器官[1-2]。同時(shí)由于機(jī)體氧供應(yīng)不足，造成活性氧(ROS)增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)可使組織損傷進(jìn)一步加重，尤其對氧敏感的腦和心肌組織易損性增加[3]。高原缺氧環(huán)境嚴(yán)重影響高原地區(qū)建設(shè)、國防軍事安全和人民身體健康。目前對高原反應(yīng)預(yù)防治療的研究越來越多，但是其機(jī)制仍不清楚。有研究表明，很多疾病的發(fā)生、發(fā)展及愈后都與性別密切相關(guān)，這種性別差異表現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)及愈后，但關(guān)于性別對高原缺氧耐受的影響未見報(bào)道[4]。本研究以健康Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，采用低壓低氧艙模擬海拔8000 m高原環(huán)境，通過比較模擬高原缺氧與正常大鼠的血液流變學(xué)、組織病理和生化指標(biāo)，探討不同缺氧時(shí)間后生理生化指標(biāo)的變化情況，旨在研究低氧對機(jī)體的影響，并探討大鼠性別與高原缺氧耐受性的關(guān)系。以期為預(yù)防和治療高原反應(yīng)提供幫助。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器 MVIS 2030全自動(dòng)血流變分析儀(重慶天?？萍加邢薰?，F(xiàn)LYDWC50-ⅡC低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司)，BP210S電子天平(荷蘭賽多利斯有限公司)，低溫離心機(jī)(德國赫利氏公司)，DK-8A型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，tissuelyser-24組織勻漿機(jī)(上海凈信有限公司)，Spectra Max i3酶標(biāo)儀(奧地利Molecular Devices公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±25)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK2014-0020。在恒溫(21～23℃)、恒濕(45%～65%)、明暗各12 h周期的飼養(yǎng)室，全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 BCA法蛋白測定試劑盒(批號(hào)：20170312)，丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號(hào)：20170413)，一氧化氮(NO)測定試劑盒(批號(hào)：20170406)，一氧化氮合成酶(NOS)測定試劑盒(批號(hào)：20170306)，過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(批號(hào)：20170512)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒(批號(hào)：20170312)，超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(批號(hào)：20170413)，Na+-K+-ATP酶活力測定試劑盒(批號(hào)：20170512)。

1.4減壓缺氧損傷模型實(shí)驗(yàn) 將100只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，缺氧1、3、5和10 d組，每組20只，雌雄各10只，分籠飼養(yǎng)并標(biāo)記。將各缺氧組放入大型低壓氧艙內(nèi)，以10 m/s速度升至海拔8000 m，分別停留1 d、3 d、5 d和10 d后，取出大鼠，采集動(dòng)脈血，進(jìn)行血液流變學(xué)指標(biāo)的測定；采集大鼠腦組織和心肌組織，進(jìn)行組織病理觀察和生化指標(biāo)測定；正常組在艙外飼養(yǎng)，同法處理，測定血液流變學(xué)指標(biāo)，組織病理觀察和生化指標(biāo)測定。

1.5觀察指標(biāo) ①血液流變學(xué)指標(biāo)檢測：各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛1 ml麻醉后，解剖腹腔，采集腹主動(dòng)脈血4 ml，立即進(jìn)行血液流變學(xué)分析；隨后離心取上層血清，進(jìn)行血清分析；測定指標(biāo)包括全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度、屈服應(yīng)力、紅細(xì)胞內(nèi)黏度。②病理組織檢測：取減壓缺氧實(shí)驗(yàn)組大鼠腦和心肌組織，清洗，10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，染色和觀察，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。③大鼠腦組織生化指標(biāo)檢測：取減壓缺氧實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織，預(yù)冷生理鹽水清洗后精密稱量100 mg，按1∶10(m/v)加入4℃的生理鹽水，進(jìn)行組織勻漿1 min，得到10%組織勻漿液。將組織勻漿液放入低溫離心機(jī)，在4℃下，3000 r/min離心10 min，離心后吸取上清液，按照試劑盒說明書操作，進(jìn)行MDA、SOD、CAT、GSH-PX、NO、NOS和Na+-K+-ATP酶的測定。

2 結(jié)果

2.1血液流變學(xué)指標(biāo) 與正常組比較，缺氧3、5和10 d組雌鼠全血黏度、卡松黏度和屈服應(yīng)力顯著升高(P<0.01)，雄鼠全血黏度、血漿黏度和屈服應(yīng)力也顯著升高(P<0.05，P<0.01)；其中雄鼠的全血黏度和屈服應(yīng)力較雌鼠增高顯著(P<0.05,P<0.01)。與正常組比較，缺氧3 d組雄鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著升高(P<0.05)，缺氧10 d組雄鼠卡松黏度顯著升高(P<0.05)，缺氧3和5 d組雄鼠紅細(xì)胞內(nèi)黏度顯著降低(P<0.05，P<0.01)。而各缺氧組雌鼠血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞內(nèi)黏度與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2大鼠腦和心肌組織病理結(jié)果 正常組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，可見血管和細(xì)胞形態(tài)正常；各缺氧模型組大鼠腦組織有明顯的細(xì)胞核固縮，細(xì)胞間隙明顯增大，組織空泡增多，且隨缺氧時(shí)間增加而愈發(fā)嚴(yán)重。見圖1。正常組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)完好；各缺氧模型組大鼠心肌組織細(xì)胞排列紊亂，肌纖維增粗，有炎性因子產(chǎn)生，肌細(xì)胞腫脹，且隨缺氧時(shí)間增加而愈發(fā)嚴(yán)重。見圖2。

2.3腦組織生化指標(biāo)比較 與正常組比較，各缺氧組雌鼠和雄鼠腦組織中CAT、SOD、GSH-PX、NOS和NO均隨缺氧時(shí)間延長逐漸降低(P<0.05)，且雄鼠的下降更為明顯。與正常組比較，各缺氧組雌鼠和雄鼠腦組織中MDA隨缺氧時(shí)間延長顯著升高(P<0.05)，而Na+-K+-ATP酶在初期缺氧時(shí)顯著下降(P<0.05)，第10天時(shí)恢復(fù)至正常水平，且雌鼠下降更為明顯。見圖3。

表1 5組大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)比較

圖1 5組大鼠腦組織病理變化(HE ×200)

圖2 5組大鼠心肌組織病理變化(HE ×200)

3 討論

高原缺氧能使體內(nèi)紅細(xì)胞增多，引起血液循環(huán)障礙，其中尤以血液黏度為重要變化指標(biāo)[5]。血液黏度的低與高代表循環(huán)功能的優(yōu)與劣或血液供應(yīng)的多與少，血液黏度增加，循環(huán)阻力升高，血流速度減慢，必然導(dǎo)致器官和組織的血液灌流量下降，造成缺血缺氧，影響組織的代謝和功能，從而產(chǎn)生高原反應(yīng)[6-7]。血液流變學(xué)分析是評(píng)價(jià)機(jī)體血液流動(dòng)和細(xì)胞變形，血液與血管和心臟之間相互作用的主要方法。因此，通過血液流變學(xué)檢測，能對高原病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸以及預(yù)后提供可靠的依據(jù)。

本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠全血黏度均有顯著性升高，表明缺氧會(huì)增加血液黏度，雌鼠血漿黏度無顯著性變化而卡松黏度和屈服應(yīng)力有顯著升高，其原因可能是由紅細(xì)胞增多及變形引起的[8]；而雄鼠血漿黏度、卡松黏度和屈服應(yīng)力均有顯著升高，表明除紅細(xì)胞增多及變形外血漿蛋白和血脂可能升高[9]。雄鼠血液黏度比雌鼠升高更明顯，可能與激素水平有差異相關(guān)。因此，對高原缺氧人群及時(shí)及早發(fā)現(xiàn)在血液流變學(xué)異常的可逆階段，并及時(shí)降低血液黏稠度，減少紅細(xì)胞，可以逆轉(zhuǎn)此過程，阻止疾病進(jìn)一步發(fā)展，對男性而言尤其重要。

腦和心肌組織是對氧最為敏感的兩大器官，本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果顯示，正常大鼠腦和心肌組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理改變。而各缺氧組大鼠的腦組織有明顯的細(xì)胞核固縮，細(xì)胞間隙明顯增大，組織空泡增多；心肌組織疏松水腫，血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管增多，炎性細(xì)胞浸潤。均隨缺氧時(shí)間增加而愈發(fā)嚴(yán)重。表明高原缺氧會(huì)造成組織病理學(xué)改變，損傷機(jī)體器官功能。

在高原缺氧的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激和能量代謝的作用至關(guān)重要。機(jī)體在高原缺氧條件下產(chǎn)生大量ROS，ROS能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化物MDA，具有細(xì)胞毒性，能引起細(xì)胞代謝及功能障礙，甚至死亡[10-11]。MDA含量可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，間接提示細(xì)胞損傷程度。而SOD和CAT是體內(nèi)天然存在的自由基清除物質(zhì)，對氧化與抗氧化平衡起至關(guān)重要的作用。GSH-PX能特異性催化GSH對氫氧化物的還原反應(yīng)，其活力的升高有利于機(jī)體清除ROS和保護(hù)機(jī)體組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[12-14]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各缺氧組大鼠腦組織中MDA含量隨著缺氧時(shí)間的延長顯著增加，SOD、CAT、GSH-PX水平隨著缺氧時(shí)間的延長均明顯降低。表明高原缺氧使抗氧化酶活力降低，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加，機(jī)體氧化與抗氧化平衡受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜基本結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步影響細(xì)胞功能，致使細(xì)胞損傷甚至死亡，從而破壞腦組織功能，影響認(rèn)知。

機(jī)體的主要能量供應(yīng)是ATP，在高原缺氧環(huán)境下，體內(nèi)ATP含量降低，造成能量供應(yīng)不足，引發(fā)疲勞感[15]。NO是血管內(nèi)皮舒張因子，NOS是NO合成的限速酶。低氧時(shí)腦組織產(chǎn)生強(qiáng)烈的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低NOS活性，同時(shí)NO的合成和釋放減少，最終導(dǎo)致血管收縮增強(qiáng)，腦動(dòng)脈壓升高[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在缺氧條件下，Na+-K+-ATP酶活性先降低后恢復(fù)，其中雌鼠較雄鼠降低更明顯，可能與激素有關(guān)；NO含量和NOS活力均有顯著性下降，且雄鼠下降更加明顯，表明雄鼠可能血管收縮更為顯著，出現(xiàn)高原頭痛癥狀的可能性更大。

綜上所述，高原缺氧可引起腦和心肌組織損傷，可能是由血液黏稠和氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的。且雌鼠和雄鼠在指標(biāo)上具有一定差異，這可能與雌激素具有擴(kuò)張血管、抗炎、抗氧化的作用有關(guān)。其具體損傷機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。