馬 娜，李佳佳，宋來陽，董 翔，康 燕，張東輝，李建瑛，許 琴，是文輝，劉江偉

(1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000；2.解放軍69240部隊(duì)醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

隨著全球變暖，中暑的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。中暑(heatstroke)是一種緊急而又威脅生命的疾病,特點(diǎn)是體溫超過40℃，它可能導(dǎo)致心、肝、腎、肺、凝血系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)器官功能紊亂，熱射病是中暑的嚴(yán)重類型，具有高死亡率和多臟器功能障礙(MODS)特性[1-2]。中暑引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，在心臟損傷中起重要作用[3]。姜黃素是一種從姜黃中提取的多酚化合物，對(duì)抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗微生物有很好的療效，在保護(hù)心、肺、肝、腎及腦神經(jīng)方面也有很好的作用[4-5]。已有大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，氧化應(yīng)激在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血管內(nèi)皮功能障礙和缺血性心臟病。細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞釋放有毒的自由基，這些細(xì)胞與蛋白質(zhì)、DNA或脂質(zhì)等細(xì)胞成分相互作用，導(dǎo)致心血管病變[6]。姜黃素預(yù)處理能否有效保護(hù)熱射病引起的心肌細(xì)胞相關(guān)損傷，降低其凋亡水平，并減少氧化應(yīng)激引起的相關(guān)損傷目前尚未見有關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用姜黃素預(yù)處理后，建立熱射病大鼠模型，通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)心肌凋亡細(xì)胞，并結(jié)合血清心肌酶和心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)，探索姜黃素預(yù)處理干熱環(huán)境熱射病大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，8～10周齡，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)[SCXK(新)2016-0001]，體重220～260 g。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度：(25 ± 2)℃，濕度：(35 ± 5)%RH，SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由攝取食水，使用許可證編號(hào)[SYXK(新)2016-0003]。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

西北地區(qū)特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)，全自動(dòng)生化儀(Mindray BS180)，BI2000圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技公司)。姜黃素購(gòu)自日本化成株式會(huì)社，羧甲基纖維素鈉購(gòu)自源葉生物，TUNEL試劑盒系A(chǔ)bcam公司產(chǎn)品，丙二醛(malondialdehyde，MDA)(生產(chǎn)批號(hào)：20160114)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(生產(chǎn)批號(hào)：20160309)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將SD大鼠放置在SPF室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每12 h明暗交替。隨機(jī)將大鼠分為5組：①常溫對(duì)照組(normal control，NC)，生理鹽水灌胃；②干熱對(duì)照組(dry-heat control，DHC)，生理鹽水灌胃；③低劑量姜黃素預(yù)處理組(L-cur)，50 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；④中劑量姜黃素預(yù)處理組(M-cur)，100 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；⑤高劑姜黃素預(yù)處理組(H-cur)，200 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；各個(gè)實(shí)驗(yàn)組連續(xù)灌胃7 d，大鼠自由飲食飲水(均經(jīng)滅菌處理)。在實(shí)驗(yàn)的第8天，除常溫對(duì)照組外，其余4組大鼠轉(zhuǎn)移至由新疆軍區(qū)總醫(yī)院自行研制的人工氣候艙(西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙)內(nèi)，環(huán)境溫度(41 ± 0.5)℃，相對(duì)濕度(10 ± 1)%，禁食禁水。復(fù)制以前建立的熱射病大鼠模型[7]，在實(shí)驗(yàn)開始的150 min，將大鼠腹3%戊巴比妥腹腔麻醉后處死，取下腔靜脈血液保存并離心15 min，-80℃保存，全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平。TUNEL法檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡(按說明書方法進(jìn)行)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算凋亡率；陽性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞核，表現(xiàn)為棕色；顯色藍(lán)色細(xì)胞核的細(xì)胞為正常細(xì)胞400倍視野下拍照，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，取其平均值。計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)(TUNEL陽性)/總細(xì)胞數(shù)(DAPI 陽性)×100%。染色及計(jì)數(shù)均采用雙盲法。檢測(cè)心臟組織中SOD活性及MDA水平，取心臟組織于冷生理鹽水中勻漿，按試劑盒方法進(jìn)行操作，采用比色法檢測(cè)SOD活性及MDA水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)熱射病大鼠血清心肌酶的影響

大鼠血清心肌酶CK、LDH結(jié)果同時(shí)顯示，DHC組明顯高于NC組(P< 0.01)，姜黃素預(yù)處理組隨著濃度的增加，各項(xiàng)指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)，各濃度組與DHC組之間及各濃度組之間均差異有顯著性 (P< 0.01)。見表1。

2.2 心肌細(xì)胞凋亡率

顯微鏡下觀察：凋亡細(xì)胞核染呈棕色(圖1)，DHC組凋亡指數(shù)[(41.31 ± 2.69)%]明顯高于NC組[(5.23 ± 0.97)%]，低、中、高姜黃素預(yù)處理組凋亡指數(shù)分別為(30.00 ± 3.93)%、(15.39 ± 2.53)%、(10.55 ± 1.55)%，呈逐漸下降趨勢(shì)，與DHC組均存在顯著性差異(P< 0.01)；姜黃素組間比較差異均有顯著性(P< 0.01)。

表1 姜黃素預(yù)處理對(duì)CK、LDH的影響Table 1 Effects of curcumin pretreatment on serum CK and LDH in the rats

注：與DHC組比較，aP<0 .01；與L-cur組比較,bP< 0.01；與M-cur組比較,cP< 0.01。

Note. Compared with the DHC group,aP< 0.01; compared with the L-cur group,bP< 0.01; compared with the M-cur group,cP< 0.01.

注：A：常溫對(duì)照組；B：干燥對(duì)照組組；C:低劑量姜黃素預(yù)處理組；D: 中劑量姜黃素預(yù)處理組；E: 高劑量姜黃素預(yù)處理組。圖1 心肌細(xì)胞凋亡圖(×400)A: NC group; B: DHC group; C: L-cur group; D: M-cur group; E: H-cur group.Figure 1 Apoptosis in the rat cardiomyocytes

注：與DHC組比較，aP< 0.01；與L-cur組比較，bP< 0.01；與M-cur組比較，cP< 0.01。圖2 姜黃素對(duì)熱射病大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)Note. Compared with the DHC group, aP < 0.01; compared with the L-cur group, bP < 0.01; compared with the M-cur group, cP < 0.01.Figure 2 Effects of curcumin on the apoptotic index of cardiomyocytes in heatstroke rats

2.3 姜黃素對(duì)熱射病大鼠心臟組織氧化應(yīng)激的影響

注：與DHC組比較，aP<0.01；與L-cur組比較，bP<0.01；與M-cur組比較，cP<0.01。圖3 姜黃素對(duì)熱射病大鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Note. Compared with the DHC group, aP< 0.01; compared with the L-cur group, bP< 0.01; compared with the M-cur group, cP< 0.01.Figure 3 Effects of curcumin on the levels of oxidative stress in the myocardium of heatstroke rats

MDA在DHC組明顯高于NC組(P< 0.01)，DHC組MDA最高，隨著姜黃素預(yù)處理組濃度的增高，MDA呈逐漸下降趨勢(shì)，各個(gè)濃度組與DHC組之間及各個(gè)濃度組之間均有顯著性差異(P< 0.01)；SOD在NC組最高，DHC組最低，兩者均有顯著性差異(P< 0.01)，隨著姜黃素預(yù)處理組濃度的增加，SOD水平呈上升趨勢(shì)，其中各個(gè)濃度組之間及各濃度組與DHC組之間均存在顯著性差異(P< 0.01)。

2.4 相關(guān)性分析

姜黃素各處理組及對(duì)照組中各項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)Pearson相關(guān)分析提示，心肌細(xì)胞凋亡與大鼠血清心肌酶CK、LDH之間存在正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)分別為r=0.302，r=0.304，P< 0.05)；心肌細(xì)胞凋亡與MDA之間存在正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為r=0.916，P< 0.01);心肌細(xì)胞凋亡與SOD之間存在負(fù)相關(guān)性(系數(shù)為r=-0.863，P< 0.01)。

3 討論

已有研究表明，心肌細(xì)胞凋亡參與沙漠干熱環(huán)境中暑過程中的心肌損傷，姜黃素預(yù)處理可以延長(zhǎng)沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠的生存時(shí)間[8-9]，因此推測(cè)姜黃素可能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡來發(fā)揮心肌損傷保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示，不同濃度的姜黃素預(yù)處理可明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率和心肌酶CK、LDH的數(shù)值，且心肌細(xì)胞凋亡與大鼠血清心肌酶CK、LDH之間存在正相關(guān)性，提示姜黃素預(yù)處理可能是通過減少心肌細(xì)胞凋亡在熱射病大鼠心肌損傷保護(hù)過程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素預(yù)處理后心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(MDA)明顯下降，而具有抗氧化酶作用的超氧化物歧化酶(SOD)明顯上升，并在Pearson相關(guān)分析中首次發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡與MDA呈正相關(guān)，與SOD呈負(fù)相關(guān)，表明姜黃素預(yù)處理可通過改變熱射病大鼠心肌氧化應(yīng)激水平來減少心肌細(xì)胞凋亡。

SOD是主要的抗氧化酶，能有效地清除體內(nèi)自由基；而MDA與線粒體膜的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，因此通過測(cè)定兩者情況可以評(píng)估機(jī)體內(nèi)氧自由基水平[10-11]。在干熱應(yīng)激下，活性氧(ROS)的增加，血漿和心臟組織中檢測(cè)到的抗氧化能力也隨著ROS的增加而降低，SOD水平降低。目前研究認(rèn)為，ROS過量的產(chǎn)生會(huì)干擾心臟相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)心臟相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生不利影響，包括細(xì)胞遷移、分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，這是導(dǎo)致心臟損傷的主要原因。Wang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Ang II受體拮抗劑纈沙坦，有效緩解了氧化應(yīng)激，阻斷Ang II信號(hào)通路，抑制了濕熱應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。此外，抗氧化基因的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，熱應(yīng)激會(huì)增加氧化應(yīng)激，并通過Ang II信號(hào)通路引起心肌細(xì)胞凋亡。在心肌組織發(fā)生缺血缺氧損傷的過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的過度激活是造成心肌細(xì)胞損傷的重要病理環(huán)節(jié)。氧化應(yīng)激是炎癥反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)，在心肌炎癥反應(yīng)過程中可產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化，再經(jīng)過氧化物酶分解生成MDA，最終造成肌纖維過度收縮，三磷酸腺苷耗竭，線粒體超微結(jié)構(gòu)損害，使依賴能量的離子泵活性降低，進(jìn)而促進(jìn)鈣超載，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[13-14]。線粒體不僅是肌細(xì)胞的動(dòng)力源和能量來源，而且還能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生中間代謝物/活性氧(ROS)等細(xì)胞過程[15]。Li等[16]研究結(jié)果表明熱應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS)的細(xì)胞增加，同時(shí)線粒體凋亡通路的活性增加。

在沙漠干熱環(huán)境下機(jī)體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)較多的氧自由基積聚，機(jī)體抗氧化能力降低，表現(xiàn)為SOD的降低和MDA的升高，進(jìn)而損傷心肌線粒體功能的同時(shí)引起凋亡通路的活性增加，從而加重心肌組織損害。姜黃素是從中藥姜黃中分離的重要活性成分，其具有抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激損傷、抗凋亡以及抗腫瘤等藥理活性。本研究認(rèn)為，姜黃素可能通過抗氧化應(yīng)激、提高線粒體膜穩(wěn)定性，在減少心肌細(xì)胞凋亡來發(fā)揮干熱環(huán)境下中暑大鼠的心肌保護(hù)作用。