袁松華，何涌泉，徐建青,2， 張曉燕,2*

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032)

高致病性流感病毒H5N1[1]、H7N9[2]感染研究均提示重癥流感樣感染的重要特征是宿主體內(nèi)免疫應(yīng)答失調(diào)，出現(xiàn)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素6(interleukin 6，IL-6)等炎癥因子以及白介素8(interleukin 8，IL-8)，C-C型趨化因子配體(C-C chemokine ligand 2，CCL2)等趨化因子過度表達(dá)，免疫學(xué)上定義為炎癥因子風(fēng)暴[3]。出現(xiàn)炎癥風(fēng)暴的宿主臨床癥狀表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱，下調(diào)淋巴細(xì)胞，出現(xiàn)重癥肺炎、肺重癥損傷等嚴(yán)重的呼吸道癥狀，是臨床轉(zhuǎn)歸不佳的重要因素[4]。從免疫機(jī)制來說，炎癥風(fēng)暴是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素[5]，主要誘發(fā)組織局部炎癥，直接損傷肺毛細(xì)血管粘膜，促使肺泡水腫和表面活性蛋白失活。失控的炎癥風(fēng)暴會進(jìn)一步彌散炎癥和肺泡結(jié)構(gòu)的破損造成機(jī)體肺血氧不足，最終發(fā)展為急性呼吸窘迫癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[6-7]。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)炎癥風(fēng)暴盡管不是呼吸道病毒感染特異性的，但與宿主感染病毒后高致死率顯著正相關(guān)[8]。團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)老年感染者炎癥應(yīng)答過度，以IL-6，IL-8為主要的炎癥、趨化因子高表達(dá)，肺內(nèi)灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)內(nèi)的炎癥因子濃度近乎外周1000倍以上[9]。另外通過老年感染者肺組織病理染色發(fā)現(xiàn)，肺泡細(xì)胞壁增厚，肺泡間隙進(jìn)一步被壓縮，更多的炎性淋巴細(xì)胞趨化至病灶，造成多處不可逆損傷。成年小鼠的流感病毒(H1N1)感染模型已經(jīng)證實[10]，流感病毒感染可有效誘發(fā)I型干擾素的迅速上調(diào)，炎癥因子前體的分泌進(jìn)一步刺激了其他炎性因子表達(dá)上調(diào)，繼而激活樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。多種固有免疫細(xì)胞迅速被動員，參與抗病毒的炎癥應(yīng)答，級聯(lián)放大炎癥應(yīng)答。在流感病毒感染過程中，炎癥風(fēng)暴如何影響老年感染者肺內(nèi)免疫細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)制尚且沒有得到解析。因此，本課題組擬利用老年小鼠感染H9N2病毒的免疫模型，重現(xiàn)肺內(nèi)炎癥風(fēng)暴，從組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)角度解析，對肺巨噬細(xì)胞、肺中性粒細(xì)胞等主要免疫細(xì)胞應(yīng)答的影響，為回答流感病毒感染引發(fā)的炎癥風(fēng)暴如何影響老年宿主臨床轉(zhuǎn)歸的科學(xué)問題提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 流感病毒

H9N2病毒經(jīng)MDCK細(xì)胞和雞胚培養(yǎng)滴定后，-80℃儲存?zhèn)溆?。實驗均在動物生物安全三級實驗?ABSL-3)中進(jìn)行。[高致病性病原微生物實驗室資格證書編號為衛(wèi)BSL3-007；中國合格評定國家認(rèn)可委員會實驗室認(rèn)可證書編號NO.CNAS BL0016]，研究方法經(jīng)過上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物倫理委員會審查(編號為：2014倫審K007號)。

1.2 實驗動物

實驗小鼠均選用SPF級別雌性C57小鼠，6～8周齡(18～19 g)和8月齡小鼠(22～24 g)(每種小鼠各30只)均購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-0016]，8月齡小鼠在上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部SPF區(qū)域[SYXK(滬)2015-0008]繼續(xù)飼養(yǎng)至18～24月齡(28～30 g)。

1.3 實驗方法

1.3.1 老年小鼠流感病毒感染方案

研究對象：受試小鼠提前24 h轉(zhuǎn)入生物安全實驗室適應(yīng)，分為老年感染組、成年感染組、老年未感染對照組以及成年未感染對照組共計4大組，每組小鼠10只。小鼠腹腔注射100 μL 1%戊巴比妥鈉溶液全身麻醉，5×106EID50H9N2流感病毒經(jīng)鼻腔攻擊，記錄各組小鼠感染后連續(xù)14 d的體重變化、生存情況。

1.3.2 石蠟切片免疫組化染色

將肺組織在10%的福爾馬林溶液，靜置固定24 h，包埋于石蠟中。蠟塊制備為10 μm切片(白片)數(shù)張備用。60℃烤片1 h，依此在二甲苯，無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇依次浸泡脫蠟3～5 min，在檸檬酸鹽緩沖液沸水浴中抗原修復(fù)5 min， PBS溶液洗滌3次，血清室溫封閉20 min，加入相應(yīng)的一抗anti-Macrophage(1∶100使用，克隆號：11H3，貨號：GTX53120)或Anti-Neutrophil Antibody(1∶100使用，克隆號：NIMP-R14，貨號：LS-C139871)，4℃孵育過夜后，PBS溶液洗去一抗后，室溫加入二抗孵育(HRP抗體)30 min，PBS溶液再次洗去二抗后，DAB溶液染色3～10 min，顯微鏡下觀察終止染色。自來水沖洗切片后，蘇木素溶液復(fù)染30 s，自來水再次洗去染液，晾干切片，封片。全部切片由奧地利TissueGnostics類流式組織定量細(xì)胞分析儀拍攝分析。

1.3.3 炎癥-趨化因子檢測

收集感染急性期內(nèi)(第1、2、3、7天)小鼠肺內(nèi)灌洗液和外周血，肺灌洗液4℃，12 000 r/min離心5 min，分裝上清，將外周血混入抗凝劑(3.8%枸椽酸鈉溶液與全血1∶9混合)重復(fù)混勻，3000 r/min離心10 min，分裝上清。分別取50 μL肺灌洗液、血漿和梯度稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品，依次加入50 μL預(yù)混多因子磁珠，50 μL PE標(biāo)記的熒光染色溶液，室溫避光孵育2 h。200 r/min離心5 min，用試劑盒內(nèi)專用的洗滌緩沖液洗1次，每管終體積為100 μL。全部標(biāo)本由美國BD公司的LSR Fortessa多色流式細(xì)胞儀分析獲取數(shù)據(jù)。

1.3.4 肺內(nèi)T淋巴細(xì)胞染色

收集感染后第7天的小鼠肺組織，含10%FBS的1640培養(yǎng)液洗滌2次，每只小鼠取2 g組織，無菌眼科剪處理成小于1 mm3組織小塊。消化液(含1%I型膠原酶和0.5%的DNase)37℃孵箱內(nèi)處理3～5 h，組織完全消散。將細(xì)胞懸液經(jīng)100 μmol/L無菌濾網(wǎng)獲得最終單細(xì)胞懸液。每個標(biāo)本選取106單細(xì)胞懸液，anti-CD4(2D4)、anti-CD8(11C) 室溫避光染色10 min，含10%FBS的PBS染色緩沖液洗滌1次，500 r/min離心5 min，棄去上清，每管終體積為100 μL。全部標(biāo)本由美國BD公司的LSR Fortessa多色流式細(xì)胞儀分析獲取數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 感染H9N2病毒后，老年小鼠出現(xiàn)炎癥風(fēng)暴，且集中在肺內(nèi)局部

收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共計四個時間點(diǎn)的外周血。圖1a定量檢測了血漿中炎癥因子(IL-6，TNF-α)趨化因子MCP-1和干擾素IFN-γ在血清中表達(dá)，除MCP-1表達(dá)量為100 pg/mL,其余因子均低于50 pg/mL。流感病毒H9N2是經(jīng)鼻腔由呼吸道入侵宿主，因此進(jìn)一步收集了收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共計四個時間點(diǎn)的肺泡灌洗液。動態(tài)分析結(jié)果顯示老年感染鼠肺內(nèi)的炎癥因子IL-6和趨化因子MCP-1異常高表達(dá)，在感染后第2天達(dá)到峰值，超過4000 pg/mL，是成年對照峰值表達(dá)量的100～1000倍(圖1b)。另外，在肺內(nèi)，不管是老年小鼠還是成年對照，均表達(dá)相近水平的炎癥因子TNF-α(峰值約1000 pg/mL)，且動態(tài)變化趨勢也一致，是兩組不同月齡小鼠感染H9N2病毒后共性的炎癥應(yīng)答。本課題組還發(fā)現(xiàn)干擾素IFN-γ 在老年小鼠感染后第7天內(nèi)表達(dá)上調(diào)，而成年對照則無應(yīng)答。

注：收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共計四個時間點(diǎn)的外周血。檢測血漿中炎癥因子(IL-6，TNF-α)趨化因子MCP-1和干擾素IFN-γ。圖1a 老年小鼠感染H9N2病毒后，外周血中炎癥-趨化因子的表達(dá)情況Note.Peripheral blood of mice infected with H9N2 virus was collected for the first 1, 2, 3, and 7 days. Chemokines (IL-6 and TNF-α), MCP-1, and IFN-γ were detected in plasma.Figure 1a Expression of inflammatory cytokines in the periphery blood of aged mice infected with H9N2 virus

注：收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共計四個時間點(diǎn)的肺灌洗液。檢測灌洗液(BAL)中炎癥因子(IL-6，TNF-α)趨化因子MCP-1和干擾素IFN-γ。圖1b 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內(nèi)炎癥-趨化因子的表達(dá)情況Note.Lung lavage fluid of mice infected with the H9N2 virus was collected on the first 1, 2, 3, and 7 days. Chemokines (IL-6 and TNF-α), MCP-1, and IFN-γ were detected in BAL.Figure 1b Expression of inflammatory cytokines in the lung of aged mice infected with H9N2 virus

2.2 感染H9N2病毒后，老年小鼠肺巨噬細(xì)胞應(yīng)答不足，中性粒細(xì)胞應(yīng)答滯后

圖2a 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內(nèi)巨噬細(xì)胞的動態(tài)變化(×200)Figure 2a Dynamic changes in alveolar macrophages of the aged mice infected with H9N2 virus

注：組織類流式定量細(xì)胞分析儀(奧地利，Tissue Gnostics公司)進(jìn)行圖像定量分析，每只小鼠肺組織切片標(biāo)本隨機(jī)選取3張，每張切片隨機(jī)選取10個高倍鏡視野，測定每個視野下免疫陽性細(xì)胞密度(單位為每平方毫米的細(xì)胞計數(shù))。與成年對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2b 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內(nèi)巨噬細(xì)胞的定量分析Note. Quantitative analysis was performed with a tissue flow quantitative cell analyzer (Austrian Tissue Gnostics). Three specimens of mouse lung tissue biopsies were randomly selected for observation at ×10 magnification. Positive cell density (cell count per mm2) was determined in each field.Compared with adult mice, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Figure 2b Quantitative analysis of alveolar macrophages in aged mice infected with H9N2 virus

利用免疫組化技術(shù)分析了急性感染期內(nèi)(第1、2、3和7天)肺巨噬細(xì)胞的動態(tài)變化，帶有藍(lán)色細(xì)胞核灰褐色小圓型細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)被判定為陽性細(xì)胞。切片應(yīng)用組織類流式定量細(xì)胞分析儀(奧地利，Tissue Gnostics公司)進(jìn)行定量分析，測定每個視野下(圖2a，圖3a)免疫陽性細(xì)胞密度(單位為每平方毫米的細(xì)胞計數(shù))。統(tǒng)計結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)H9N2感染后，老年小鼠的肺內(nèi)巨噬細(xì)胞(圖2b)在感染后第1天迅速趨化，增殖，但是顯著弱于成年小鼠。感染后時間動態(tài)變化提示，肺內(nèi)巨噬細(xì)胞在感染后第1天達(dá)到峰值，第2、3和7天逐漸減少。同時觀察免疫組化染色肺內(nèi)原位中性粒細(xì)胞的應(yīng)答情況。小鼠感染H9N2病毒后，肺內(nèi)中性粒細(xì)胞(圖3b)在第1、2天增加，第2天達(dá)到峰值，然后在感染后第3至第7天逐漸減少。與巨噬細(xì)胞不同的是，老年小鼠在感染第1、2天顯著低于成年對照，而在感染后第3至第7天卻顯著高于成年對照。這樣的實驗現(xiàn)象提示，與成年對照相比，感染H9N2病毒的老年小鼠肺巨噬細(xì)胞應(yīng)答不足，而肺中性粒細(xì)胞感染急性早期應(yīng)答同樣不足，但在急性后期卻在肺內(nèi)大量滯留。

圖3a 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內(nèi)中心粒細(xì)胞的動態(tài)變化(×200)Figure 3a Dynamic changes of pulmonary neutrophils in the aged mice infected with H9N2 virus

注：組織類流式定量細(xì)胞分析儀(奧地利，Tissue Gnostics公司)進(jìn)行圖像定量分析，每只小鼠肺組織切片標(biāo)本隨機(jī)選取3張，每張切片隨機(jī)選取10個高倍鏡視野，測定每個視野下免疫陽性細(xì)胞密度(單位為每平方毫米的細(xì)胞計數(shù))。與成年對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3b 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的定量分析(×200)Note. Quantitative analysis was performed with a tissue flow quantitative cell analyzer. Three specimens of mouse lung tissue biopsies were randomly selected for observation at ×10 magnification. Positive cell density (cell count per mm2) was determined in each field. Compared with the adult mice, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Figure 3b Quantitative analysis of pulmonary neutrophils in the aged mice infected with H9N2 virus

注：收集小鼠感染H9N2病毒后第7天的肺組織，消化成單細(xì)胞，計數(shù)肺內(nèi)總細(xì)胞數(shù)量。陰性分選肺內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞。分別計數(shù)后，計算CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞占肺內(nèi)總細(xì)胞的比例。與成年對照組比較，*P<0.05。圖4 老年小鼠感染H9N2病毒后第7天，肺內(nèi)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例Note. Lung tissue of mice infected with H9N2 virus was collected at day 7, digested into single cells, and the total number of cells was counted. CD4+ and CD8+ T lymphocytes were negatively sorted. After counting, the ratio of CD4+ T and CD8+ T lymphocytes to the total cells in the lung was calculated. Compared with adult mice, *P<0.05。Figure 4 Number and proportion of pulmonary T cells in the aged mice at day 7 post-infection

2.3 感染H9N2病毒后第7天，老年小鼠肺內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少。

在感染后第7天收集小鼠肺臟，肺臟在I型膠原酶消化液中解離成單個細(xì)胞懸液，對于肺內(nèi)總細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。分別使用StemCellTMCD4或CD8陰性磁珠分選試劑盒分選出對應(yīng)的T淋巴細(xì)胞，分別進(jìn)行計數(shù)。取其中部分細(xì)胞分別在表面染色標(biāo)記CD4-FITC、CD8-PE，結(jié)果顯示陽性率大于95%(數(shù)據(jù)未展示)。統(tǒng)計結(jié)果(圖4)顯示未感染條件下，與成年對照相比，老年小鼠肺內(nèi)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例無顯著性差異。感染H9N2病毒后第7天，CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例以及CD8+T淋巴細(xì)胞的比例則依然維持不變，而老年小鼠肺內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量則顯著降低。

3 討論

本團(tuán)隊前期臨床研究發(fā)現(xiàn)H7N9的老年感染者主要過量上調(diào)炎癥因子IL-6、趨化因子IL-8，另一種重要的炎癥因子TNF-α等卻沒有發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)。重癥感染后，免疫穩(wěn)態(tài)的失衡，宿主體內(nèi)產(chǎn)生炎癥風(fēng)暴[9]。但I(xiàn)L-6、IL-8的分泌占據(jù)大部分的比例，是否抑制了其他炎癥通路的活化或是其他通路活化的負(fù)反饋，促進(jìn)IL-6、IL-8因子的高表達(dá)。IL-10是一種通常意義的負(fù)向調(diào)控因子，主要功能是調(diào)節(jié)免疫平衡，防止免疫應(yīng)答過度活化[11]。臨床研究中三名危重病人肺內(nèi)灌洗液中檢出很少的IL-10因子表達(dá)，肺內(nèi)炎癥因子選擇性暴增的機(jī)制目前沒有得到解析。老年小鼠感染H9N2病毒后，炎癥因子IL-6、趨化因子MCP-1同樣在小鼠肺內(nèi)過量表達(dá)，老年小鼠肺內(nèi)炎癥風(fēng)暴主要以炎癥因子IL-6和趨化因子MCP-1為主，峰值表達(dá)超過4000 pg/mL，而成年小鼠肺內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)上調(diào)，峰值表達(dá)500～1000 pg/mL。有意思的是，本課題組在感染后癥狀輕微的成年小鼠肺內(nèi)灌洗液中檢測出負(fù)調(diào)控因子IL-10上調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。老年小鼠感染H9N2后，與成年被感染小鼠相比，體重下降顯著，死亡率僅為50%。因此，高水平的炎癥因子風(fēng)暴對應(yīng)了重癥的臨床轉(zhuǎn)歸情況，與本團(tuán)隊2013年度H7N9感染者臨床現(xiàn)象相符。

肺巨噬細(xì)胞是一群定居在肺組織內(nèi)固有免疫細(xì)胞，對于維持肺組織免疫穩(wěn)態(tài)具有關(guān)鍵作用[12]。與其他類型巨噬細(xì)胞明顯不同，肺巨噬細(xì)胞在原位自我更新[13]，而不是從遷徙來的單核細(xì)胞分化更新[14]。肺巨噬細(xì)胞主要參與靜息狀態(tài)下肺組織的損傷修復(fù)、宿主抵御系統(tǒng)性抗病毒或細(xì)菌的感染。小鼠感染H9N2流感病毒后，肺巨噬細(xì)胞結(jié)合出現(xiàn)凋亡的靶細(xì)胞且降解處理，其分子機(jī)制已經(jīng)在體外細(xì)胞模型中報道，肺巨噬細(xì)胞表面高水平表達(dá)的CD204分子，是重要的肺內(nèi)清除功能受體[15]。另外有報道發(fā)現(xiàn)衰老的肺巨噬細(xì)胞表面的CD204分子表達(dá)下降，與清除凋亡細(xì)胞功能的下降呈正相關(guān)[16]。本課題組的研究發(fā)現(xiàn)老年小鼠感染H9N2病毒后，肺巨噬細(xì)胞上調(diào)顯著低于成年對照。呼吸道病毒感染過程中，肺巨噬細(xì)胞主要是通過分泌I型干擾素招募炎癥單核細(xì)胞[17]。肺巨噬細(xì)胞不是唯一的肺內(nèi)具有免疫吞噬功能的固有免疫細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞以及被招募的單核淋巴細(xì)胞同樣承擔(dān)一系列的免疫吞噬能力。相對于年輕對照，感染H9N2病毒的老年小鼠肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的滯留更加嚴(yán)重。大量的中性粒細(xì)胞的富集在肺組織局部，進(jìn)一步惡化了肺內(nèi)炎性環(huán)境，造成更嚴(yán)重的肺損傷。肺內(nèi)的高炎性環(huán)境招募中性粒細(xì)胞的侵潤，大量的中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)長時間滯留，又進(jìn)一步上調(diào)炎癥因子，最終造成肺損傷。因此，老年小鼠感染H9N2病毒后，肺內(nèi)參與抗感染的固有免疫應(yīng)答細(xì)胞種類沒有發(fā)生改變，但值得注意的是，巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)的數(shù)量出現(xiàn)顯著下降，中性粒細(xì)胞的遷徙能力同樣發(fā)生顯著減弱。

在流感病毒感染免疫過程中，相對于固有免疫應(yīng)答，獲得性免疫應(yīng)答是抗原特異的，由專職的抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行抗原處理加工，因此免疫應(yīng)答的發(fā)生時相要晚于非特異應(yīng)答。在感染免疫應(yīng)答期，感染H9N2的老年小鼠肺內(nèi)輔助性T細(xì)胞的比例和數(shù)量，與成年小鼠相當(dāng)。但有報道指出在致死性流感模型中，老年小鼠肺間質(zhì)中定居的CD69+CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著下降[18]，這群特殊的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)具有長時間生存能力，同時是抗流感病毒感染的重要T細(xì)胞亞群。本課題組研究同樣確認(rèn)了重癥感染流感病毒的老年小鼠肺內(nèi)CD8+T細(xì)胞的顯著減少，證實感染后特異性細(xì)胞殺傷應(yīng)答的強(qiáng)度顯著降低，但具體屬于哪類亞群還需要進(jìn)一步確認(rèn)。

與其他年齡對照組相比，老年人群在重癥流感感染過程中有合并下呼吸道感染的風(fēng)險。臨床上肺部聽診、C反應(yīng)蛋白以及胸部射線檢查均提示老年流感重癥感染者具有較高的肺部感染發(fā)生率。本課題組前期建立的老年小鼠感染流感免疫模型已經(jīng)確認(rèn)老年宿主感染流感病毒后預(yù)后不佳。感染流感病毒后，老年小鼠肺內(nèi)炎癥因子的異常高水平上調(diào)，導(dǎo)致肺巨噬細(xì)胞的應(yīng)答下降，中性粒細(xì)胞遷徙能力減弱，過量表達(dá)的炎癥進(jìn)一步下調(diào)了老年小鼠肺內(nèi)CD8+T細(xì)胞，削弱了抗感染的細(xì)胞毒殺傷應(yīng)答。因此，高水平的炎癥風(fēng)暴直接或間接導(dǎo)致老年小鼠出現(xiàn)重癥的臨床轉(zhuǎn)歸，但肺內(nèi)炎癥風(fēng)暴如何調(diào)控肺內(nèi)固有免疫細(xì)胞應(yīng)答的分子學(xué)相關(guān)機(jī)制還有待于后續(xù)的研究。