王東輝 潘彥舒 郭洋洋 郭 婕 程曉娜 韓振蘊(yùn)

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

在前期的臨床觀察中，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者腦內(nèi)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)存在含量失衡的情況，表現(xiàn)為5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)↑、多巴胺(Dopamine,DA)↓，乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)↑、去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)↓[1]。據(jù)此臨床現(xiàn)象，本團(tuán)隊(duì)建立了以腦內(nèi)神質(zhì)失衡為特征的抑郁癥大鼠模型[2]。原造模方法需要安裝套管用以向左側(cè)海馬給藥。套管安裝后，注射多巴胺D1受體抑制劑SCH23390，以打破雙側(cè)海馬和大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的平衡，藥物的劑量為2 μg/μL×1 μL/d，每注射2 d，休息1 d，反復(fù)3次，共計(jì)給藥6次。然而，安裝給藥用套管會(huì)增加造模時(shí)間，且不利于強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和水迷宮等實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。所以，本實(shí)驗(yàn)希望去除套管的安裝，提高給藥劑量，減少給藥次數(shù)，以優(yōu)化造模過(guò)程，并觀察改良模型的有效性和病理特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠26只，體重250～270 g，購(gòu)買自北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004]。飼養(yǎng)條件為：溫度(22±1)℃；濕度(47±2)%；12 h晝夜交替光照，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.1.2 試劑及儀器 SCH23390(Sigma，批號(hào)：125M4614V)，5-HT(上海阿拉丁，批號(hào)：S111161)，DA(上海阿拉丁，批號(hào)：D103111)，NE(上海阿拉丁，批號(hào)：D134211)，5-HIAA(上海阿拉丁，批號(hào)：H133485)。

68003型腦立體定位儀(瑞沃德生命科技有限公司，深圳)，78001型顱骨鉆(瑞沃德生命科技有限公司，深圳)，API3200型液質(zhì)聯(lián)用儀(Applied Biosystems)，UltiMate3000型高效液相色譜儀(Dionex)，MULTISKANMK3型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo)

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 大鼠采用單籠飼養(yǎng) 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)糖水消耗實(shí)驗(yàn)情況，將健康大鼠隨機(jī)分組：正常對(duì)照組9只、原模型組11只、改良模型組11只。

1.2.1.2 模型的制備 第1次給藥時(shí)用10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,ip，后3次給藥以乙醚吸入麻醉。將麻醉好的大鼠放置于帶有微量注射器的腦立體定位儀上，依據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦圖譜所示[3]，定位大鼠左半側(cè)海馬(AP-3 mm,L 1.8 mm,H 3 mm)。使用顱骨鉆在顱骨相應(yīng)位置打孔，緩慢將微量注射器插入所需深度，注射SCH23390，劑量為8 μg/μL×1 μL/d，隔1 d給藥1次，共給藥4次。

1.2.1.3 原模型制備 1)安裝給藥用套管：原模型組以10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,腹膜內(nèi)給藥，將麻醉好的大鼠放置于腦立體定位儀上，依據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦圖譜，定位左側(cè)海馬(AP-3 mm,L 1.8 mm,H 3 mm),使用顱骨鉆在顱骨相應(yīng)位置打孔，植入一微量注射用套管(直徑0.56 mm，長(zhǎng)度3.2 mm)和2枚配套螺絲，用牙托水、牙托粉固定。術(shù)后大鼠自由飲水飲食，連續(xù)3 d青霉素2×104單位,腹膜內(nèi)給藥，恢復(fù)1周后給藥；2)給藥：大鼠吸入乙醚麻醉，使用微量注射器，通過(guò)套管向海馬注射SCH23390，劑量為2 μg/μL×1 μL，每給藥2 d，休息1 d，共給藥6 d。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.2.1 體重及行為學(xué)測(cè)試 正常對(duì)照組不做處理，給藥后兩周進(jìn)行體重及行為學(xué)測(cè)試。1)體重測(cè)定：于成模后第14天進(jìn)行體重測(cè)定；2)糖水消耗實(shí)驗(yàn)：依據(jù)文獻(xiàn)[4]并加以調(diào)整，于成模后第14天進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn)，配制1%的蔗糖水，每只大鼠第1天給予2瓶蔗糖水，第2天給予1瓶蔗糖水和1瓶大鼠飲用水，第3天禁食禁水24 h，24 h后將1瓶重200 g的1%蔗糖水和1瓶重200 g的飲用水給予每只大鼠。于12 h后取走2種液體，并稱量每瓶液體所剩質(zhì)量，依據(jù)公式糖水偏愛(ài)率(%)=糖水消耗/總液體消耗×100%，求得每只大鼠的糖水偏愛(ài)率。3)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[5]：依據(jù)文獻(xiàn)并加以調(diào)整，于成模后第14天進(jìn)行，自制1個(gè)100 cm×100 cm×40 cm木箱，黑色，有底無(wú)蓋，用白線將底部均勻劃成5×5個(gè)方格。在安靜、光線昏暗的環(huán)境下，將大鼠從同一位置、同一方向放置于木箱的中央，大鼠自由活動(dòng)。計(jì)算5 min內(nèi)大鼠活動(dòng)的水平運(yùn)動(dòng)得分(大鼠四肢均穿過(guò)的方格數(shù)，若沿線行走，則以20 cm為1格)和垂直運(yùn)動(dòng)得分(兩前肢完全抬離地面至少1 cm或攀爬箱壁至放下的次數(shù))。在2只大鼠測(cè)試間歇，使用低濃度乙醇溶液擦拭敞箱，以防止上一只大鼠所留氣味對(duì)其后大鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.2.2.2 病理學(xué)檢測(cè) 1)取材：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，斷頭后，取出腦組織，分離大腦皮質(zhì)及左、右海馬，裝入離心管中，放于-20 ℃冰箱中備用。2)HLPC-MS測(cè)量皮層、左右海馬中5-HT、DA、NE、5-HIAA含量：取組織，滴下生理鹽水，勻漿。取勻漿液50 μL，加入含有內(nèi)標(biāo)異丙腎上腺素的甲醇200 μL，斡旋1 min后，13 000 r/min離心4 min，保證溫度在4 ℃作用。取上清液，備用。色譜條件：流動(dòng)相：A水相：水(0.1%甲酸)，B有機(jī)相：乙腈(0.1%甲酸)，色譜柱：MSLab C18(150×4.6 mm 5 μm)，柱溫：50 ℃。進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL/min。質(zhì)譜條件：離子源，采用+ESI電噴霧離子源；噴霧電壓為4 800 V；霧化氣為50 psi；輔助氣為60 psi；碰撞氣為Medium；霧化溫度為500 ℃；氣簾氣為20 psi；碰撞室射入電壓:10，射出電壓:2.0，掃描方式為MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。MRM(NE)=170.1/152.1，MRM(DA)154.1/137.1，MRM(5-HIAA)192.06/146.06，MRM(5-HT)=177.1/160.1，MRM(Is)=271.03/156.01。

1.2.2.3 ELISA法檢測(cè)大腦皮質(zhì)及雙側(cè)海馬中AchE的含量，依據(jù)ELISA試劑盒手冊(cè)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 體重及行為學(xué)測(cè)定結(jié)果 造模2周后，同正常對(duì)照組比較，改良模型組糖水偏愛(ài)率顯著降低(P<0.05)，體重、曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)水平和垂直運(yùn)動(dòng)均極顯著降低(P<0.01)。與原模型組比較，改良模型組糖水偏愛(ài)率、體重變化率、曠場(chǎng)試驗(yàn)水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 左側(cè)海馬神經(jīng)遞質(zhì)及AchE含量 造模兩周后，同正常對(duì)照組比較，改良模型組大鼠左側(cè)海馬5-HT、NE含量極顯著升高(P<0.01)；5-HIAA含量極顯著減少(P<0.01)；DA含量呈降低趨勢(shì)，AchE含量呈升高趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 右側(cè)海馬神經(jīng)遞質(zhì)及AchE含量 造模兩周后，同正常對(duì)照組比較，改良模型組大鼠右側(cè)海馬5-HT、NE含量極顯著升高(P<0.01)；5-HIAA含量極顯著減少(P<0.01)；DA含量呈減少趨勢(shì)，AchE含量呈增加趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及AchE含量 造模兩周后，同正常對(duì)照組比較，改良模型組大鼠大腦皮質(zhì)中5-HT、NE、AchE含量呈升高趨勢(shì)；5-HIAA、DA含量呈降低趨勢(shì)(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表1 各組大鼠體重及行為學(xué)變化

注：與正常對(duì)照組比較,**P<0.01;與正常對(duì)照組比較,*P<0.05

表2 左側(cè)海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及AchE含量變化

注：與正常對(duì)照組比較,**P<0.01

表3 右側(cè)海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及AchE含量變化

注：與正常對(duì)照組比較,**P<0.01

表4 大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及AchE含量變化

3 討論

抑郁癥的動(dòng)物模型有許多，主要可以分為手術(shù)模型、藥物介導(dǎo)模型、應(yīng)激模型和遺傳模型等[6]。這些模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于抑郁癥的研究中，但每種模型都存在一定的缺陷，如：慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(CUMS)模型造模時(shí)需要保障造模環(huán)境的一致性，且造模耗時(shí)長(zhǎng)，增加了工作量；嗅球摧毀模型是創(chuàng)傷性模型，大鼠死亡率較其他模型較高，增加了實(shí)驗(yàn)成本；遺傳模型不能完全模擬抑郁癥的發(fā)病過(guò)程，且應(yīng)用不廣泛。因此，開(kāi)發(fā)新的抑郁癥模型對(duì)抑郁癥的研究意義重大。

在之前的研究中，本團(tuán)隊(duì)根據(jù)在體檢測(cè)臨床抑郁癥患者腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化規(guī)律建立了一種新的抑郁模型，該模型以腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)失衡為主要特征，在行為學(xué)表現(xiàn)上也符合抑郁癥的特征。但是在造模過(guò)程中需要安裝套管，這延長(zhǎng)了造模時(shí)間，且不利于水迷宮、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。所以，本實(shí)驗(yàn)取消了套管的安裝，提高給藥劑量、減少給藥次數(shù)，以縮短造模用時(shí)。

改良的造模方法為向左側(cè)海馬注射SCH23390，劑量為8 μg/μL×1 μL/d，給藥頻率為隔1 d給藥1次，共4次。改良模型造成的抑郁狀態(tài)依據(jù)行為學(xué)評(píng)價(jià)[7-8]?！翱旄腥笔А笔且钟舭Y的核心癥狀[9]，是指抑郁癥患者體驗(yàn)快樂(lè)能力的下降。糖水消耗實(shí)驗(yàn)即是評(píng)估抑郁癥動(dòng)物模型的“快感缺失”情況[10]。抑郁癥患者自主活動(dòng)減少，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察動(dòng)物在陌生環(huán)境下穿越格子數(shù)、抬爪次數(shù)評(píng)價(jià)動(dòng)物模型自主活動(dòng)和探索行為的改變。常用的抑郁模型，如CUMS模型、習(xí)得性無(wú)助模型，糖水偏愛(ài)率、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分均下降[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中，改良模型的體重、糖水偏愛(ài)率、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平及垂直運(yùn)動(dòng)得分均降低，表明改良的造模方法可以造成大鼠的抑郁狀態(tài)。而同原模型比較，改良模型上述指標(biāo)未有明顯改變，表明改良模型、原模型所造成的抑郁程度相同。

經(jīng)典的單胺遞質(zhì)假說(shuō)認(rèn)為抑郁癥的發(fā)病與5-HT、NE、DA含量的改變有關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示左、右側(cè)海馬5-HT、NE含量極顯著增加、5-HIAA含量極顯著減少，DA含量呈降低趨勢(shì)；大腦皮質(zhì)內(nèi)5-HT、NE含量呈增加趨勢(shì)，5-HIAA和DA含量呈降低趨勢(shì)，這與王援朝[14]的觀察結(jié)果相一致或呈現(xiàn)相應(yīng)趨勢(shì)，也與原抑郁癥模型的神經(jīng)遞質(zhì)改變相同。

AchE是Ach的水解酶，由于Ach性質(zhì)不穩(wěn)定，所以經(jīng)常通過(guò)觀察AchE含量的改變反應(yīng)Ach含量的變化。抑郁大鼠腦組織中AchE增加[15]，而本實(shí)驗(yàn)中AchE含量呈升高趨勢(shì)，這與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

綜上所述，改良的造模方法能夠造成大鼠抑郁狀態(tài)，所造成的抑郁狀態(tài)與原模型相同，但因其減少了造模時(shí)間、所造模型可以用于強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、或水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)原模型改良的目的。