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(1.溫州出入境檢驗檢疫局,浙江溫州 325027；2.紹興出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心,浙江紹興 312000)

葡萄酒是以新鮮葡萄果實為原料釀造的一種果酒。然而，在葡萄種植過程中為了提高產(chǎn)量，需要使用殺菌劑、殺蟲劑和除草劑等農(nóng)藥控制病蟲草害，而殘留在葡萄中的農(nóng)藥會隨著發(fā)酵過程遷移至葡萄酒中，因而葡萄酒中經(jīng)常殘留多種農(nóng)藥。殺菌劑是用于防治各種病原微生物引起的植物病害的一類低毒農(nóng)藥，常用于防治葡萄霜霉病、白粉病、黑痘病等病蟲害。隨著我國人民生活水平的日益提高，葡萄酒進口量持續(xù)攀升。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，在2017年的前10個月中，中國總共進口了6.013億升葡萄酒，進口總額達到22.1億美元，同比分別上漲了18.92%和15.16%[1]。目前，我國還未針對葡萄酒設(shè)定農(nóng)藥殘留限量，我國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB2763-2016)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》僅對原料葡萄設(shè)定了農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[2]。為了提高進口及內(nèi)銷葡萄酒的質(zhì)量安全，建立葡萄酒中農(nóng)藥殘留分析方法對于監(jiān)管機構(gòu)提供技術(shù)支持、保障國人食品安全具有重要意義。

近年來，關(guān)于葡萄酒中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要集中在氣相色譜-質(zhì)譜法[3 - 7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8 - 14]，前處理主要采用QuEChERS[3 - 5,13 - 14]、固相萃取[7 - 12]、固相微萃取[6,15]等。硅噻菌胺、氟吡菌胺、吲哚磺菌胺和啶酰菌胺是近年來德國、美國、日本等國農(nóng)藥公司開發(fā)的新型殺菌劑，目前國內(nèi)外研究報道較少，尚未見同時測定葡萄酒中該4種殺菌劑的檢測方法。葡萄酒樣品基質(zhì)復(fù)雜，為對其中含有的痕量殺菌劑進行準(zhǔn)確定性和定量，本研究采用聚合物填料的固相萃取小柱一步完成提取和凈化，采用高選擇性和靈敏度的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析，方法快速簡便，抗干擾能力強，適合批量葡萄酒樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Trace1300/TSQ8000氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，賽默飛公司)；24管固相萃取儀(美國，賽默飛公司)；Milli-Q超純水器(美國，Millipore公司)。HR-X固相萃取柱(德國MN公司，60mg/3mL)。

硅噻菌胺(純度98.0%，CASNo.175217-20-6)、氟吡菌胺(純度99.0%，CASNo.239110-15-7)、吲哚磺菌胺(純度99.0%，CASNo.348635-87-0)、啶酰菌胺(純度99.0%，CASNo.188425-85-6)，均購自德國Dr.EhrenstorferGmbH公司。甲醇、乙酸乙酯均為色譜純(美國TEDIA公司)；其他試劑未說明均為分析純。

葡萄酒樣品來自客戶委托檢測樣品。

1.2 樣品前處理

取1g酒樣，加入1mL水，混勻，加入到已預(yù)先活化好(依次用3mL甲醇、3mL水活化)的HR-X小柱上，自然重力過柱后真空抽干3min，先用0.5mL乙酸乙酯洗脫，棄去流出液，再加乙酸乙酯洗脫，于刻度離心管中收集洗脫液1mL，直接供GC-MS/MS測定。

1.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取各殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品25mg，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中定容，配制成1000mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取適量儲備液用乙酸乙酯稀釋配制成1000ng·mL-1和100ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?；|(zhì)校準(zhǔn)工作溶液制備：選取葡萄酒樣品，按照1.2節(jié)方法進行樣品處理并供GC-MS/MS測定，確認(rèn)不含4種目標(biāo)物后，再取該葡萄酒7份進行樣品處理以獲取空白基質(zhì)液，分別取1000ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100、50、20μL，各加入900、950、980μL空白基質(zhì)液，得100、50、20ng·mL-1的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取100ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100、50、20μL，各加入900、950、980μL空白基質(zhì)液，得10、5、2ng·mL-1的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取5mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用AUTOSRM模式進行質(zhì)譜條件自動優(yōu)化，首先在全掃描模式下選取母離子，在確定母離子后，采用子離子掃描方式進行二級質(zhì)譜分析，進一步優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，使各分析化合物的響應(yīng)最大化。質(zhì)譜參數(shù)及母離子和子離子詳見表1，各物質(zhì)定量離子對的MRM圖見圖1。

圖1 4種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.0ng·mL-1)的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of standard solution of four fungicides(5.0 ng·mL-1)

CompoundtR(min)Parent ion(m/z) Daughter ion(m/z)CE(eV)CompoundtR(min)Parent ion(m/z) Daughter ion(m/z)CE(eV)Silthiofam8.27252.1197*12Amisulbrom13.27225.9119.9*30252.121012225.9146.928Fluopicolide11.06347171.9*18Boscalid13.57342.111238347176.126342.1140*12

*quantification ion.

2.2 固相萃取小柱的選擇和優(yōu)化

分別試驗了HR-X小柱(60 mg/3mL，德國BESTOWN公司)、C18小柱(1 000 mg/6mL，德國BESTOWN公司)、HLB小柱(500 mg/6mL，上海安譜公司)，發(fā)現(xiàn)HLB小柱對目標(biāo)物的吸附較強，用乙酸乙酯不易洗脫，用甲醇雖然能洗脫下來，但是葡萄酒中本已吸附在小柱上的色素也同時被洗脫下來，凈化效果差；比較HR-X小柱和C18小柱，回收率均較好，但是后者需要3 mL乙酸乙酯才能洗脫目標(biāo)物，洗脫液還需氮吹濃縮后才能供GC-MS/MS測定，而前者只要1 mL乙酸乙酯就能洗脫目標(biāo)物，且洗脫液能直接供GC-MS/MS測定。故本實驗最終選擇HR-X小柱(60 mg/3mL)做前處理吸附和凈化。

2.3 方法的線性范圍與相關(guān)系數(shù)

實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)效應(yīng)，空白樣品按照1.2節(jié)前處理，配制一系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進行測定。結(jié)果表明，4種殺菌劑在2.0～100.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性，得到的線性方程、相關(guān)系數(shù)見表2。在實際樣品加標(biāo)2.0 μg·kg-1中，各物質(zhì)的信噪比(S/N)：硅噻菌胺24.6；氟吡菌胺89.9；吲哚磺菌胺17.6；啶酰菌胺37.4，均大于10，滿足定量要求，故本方法將4種殺菌劑的定量限定為2.0 μg·kg-1。

表2 4種殺菌劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.4 加標(biāo)回收率

取空白葡萄酒樣品進行濃度分別為2.0、5.0、20.0 μg·kg-1的4種殺菌劑加標(biāo)回收率實驗，按照本方法進行測定，方法平均回收率為77.2%～93.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于7.8%?；厥章逝c相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)列于表3。由表3可知該方法顯示了較好的回收率與精密度。

表3 葡萄酒中4種殺菌劑加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)(n=6)

2.5 實際樣品測定

對客戶委托的100批次葡萄酒樣品按本方法進行了測定，均未檢出4種殺菌劑。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄酒中硅噻菌胺、氟吡菌胺、吲哚磺菌胺和啶酰菌胺的分析方法。該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏，可用于葡萄酒中4種殺菌劑的測定。