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(江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 360102)

對硫磷是一種廣譜性殺蟲、殺螨劑，對害蟲具有強(qiáng)烈的觸殺和胃毒作用，為膽堿酯酶抑制劑[1]。對硫磷可殘留在大米、雞肉、豬肉、牛肉、大蒜、洋蔥、蘋果等食物中，其限量指標(biāo)一般為0.1mg/kg。目前，有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜法(GC)，以及與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS和GC-MS)等[1 - 3]。樣品的前處理方法對于農(nóng)藥殘留分析來說十分關(guān)鍵。常用的前處理方法有液-液萃取和固相萃取[4 - 5]，但多數(shù)固相萃取吸附劑都有選擇性差的缺點(diǎn)。分子印跡聚合物(MIPs)對目標(biāo)分子具有特異選擇性吸附[6 - 8]，已用于水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留分析[9 - 12]。但大多數(shù)MIPs的制備采用傳統(tǒng)有機(jī)聚合方法，存在識別位點(diǎn)不均一，傳質(zhì)阻力大，選擇性差，動力學(xué)平衡慢的缺點(diǎn)。本文選擇球形硅膠為載體，采取不同于有機(jī)自由基聚合方式，通過溶膠-凝膠方法制備對硫磷分子印跡聚合物，并以其作為吸附材料，結(jié)合高效液相色譜法，成功地用于西紅柿樣品中對硫磷的選擇性富集和檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

L-550臺式低速離心機(jī)(長沙市湘儀離心機(jī)有限公司)；UV-2450型紫外-可見分光光度計、SS-550掃描電子顯微鏡(日本，島津公司)；VARIO-EL元素分析儀(德國，Elementar公司)；AVATAR360傅立葉紅外光譜(美國，Nicolet公司)；LC-20AT高效液相色譜(日本，島津公司)。

有機(jī)磷農(nóng)藥對硫磷(PT)、對氧磷(PO)、三唑磷(TPO)和喹硫磷(QP)標(biāo)準(zhǔn)品，均購于德國Dr.EhrenstorferGmbH公司；四乙氧基硅烷(TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、苯基三甲氧基硅烷(PTMOS)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，均購于AlfaAesar化學(xué)試劑公司；甲醇、乙腈、無水乙醇和乙酸，均購于天津市康科德科技有限公司；其他試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 對硫磷分子印跡聚合物的制備

采用溶膠-凝膠法制備對硫磷分子印跡聚合物。具體過程如下：稱取200mg粒徑大約為50μm球形硅膠，分散在10mL無水乙醇中，然后加入交聯(lián)劑TEOS3mL，功能單體APTES和PTMOS各200μL，室溫振蕩30min后，加入0.1mol·L-1的對硫磷乙醇溶液800μL，二次蒸餾水1mL，濃HCl100μL，室溫下反應(yīng)24h。產(chǎn)物先用無水乙醇洗滌三次，干燥。然后用甲醇-乙酸(9∶1,V/V)洗脫聚合物中的模板分子，直至洗滌液在275nm處無紫外吸收。用甲醇洗滌印跡聚合物三次以除去殘留的乙酸，最后在60℃條件下真空干燥至恒重，即得到對硫磷分子印跡聚合物(MIPs)。非印跡聚合物(NIPs)的制備除不加入模板分子對硫磷外，其它步驟相同。

1.3 對硫磷分子印跡聚合物應(yīng)用于西紅柿樣品中對硫磷的檢測

西紅柿樣品的制備參考文獻(xiàn)方法[13 - 14]并稍作改進(jìn)：稱取西紅柿樣品100g，洗凈并攪拌成汁，再用100mL乙腈萃取，攪拌5h，靜置抽濾后用50mL正己烷萃取。萃取液中加入50mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.6)。分別移取溶液10mL，三份，加入2、5、10μL100mg·L-1對硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別用20mL乙醇、20mL水活化對硫磷MIPs和NIPs固相萃取小柱，抽干后上樣，向柱子中加入不同批次、不同添加水平的西紅柿樣品，上樣體積為1mL，共計10次，使樣品緩慢通過分子印跡固相萃取小柱后，用3mL丙酮淋洗，再用3mL乙醇洗提，得到洗提液。將洗提液氮吹干后，用1mL色譜流動相重新定容，再用高效液相色譜測定對硫磷的濃度。每個添加水平平行測3次。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：VP-ODSC18柱(150×4.6mm,5μm;日本島津);流動相：乙腈-水(70∶30,V/V);流速1.0mL/min;進(jìn)樣體積100μL;檢測波長278nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 對硫磷分子印跡聚合物的表征

圖1為硅球、對硫磷分子MIPs和NIPs的掃描電鏡(SEM)圖。由圖可見，與裸硅球相比MIPs和NIPs包覆的硅球，表面粗糙度增加，但是形成的膜層較薄，使粒徑幾乎沒有變化，形狀仍為球形，大小約為50μm。分別取一定量硅球和MIPs包覆的硅球，采用KBr壓片法，掃描他們的紅外光譜(圖略)，結(jié)果顯示在1100cm-1處有Si-O伸縮振動特征吸收峰；相比于裸硅球，MIPs包覆的硅球在1470cm-1和1580cm-1處有NH2的特征吸收峰出現(xiàn)，說明硅球表面已包覆上APTES，但是圖中苯基1400cm-1～1600cm-1的峰可能與NH2的特征吸收峰重疊。進(jìn)一步對硅膠和MIPs包覆的硅球進(jìn)行元素分析，相比于硅球，發(fā)現(xiàn)MIPs包覆的硅球中C元素的百分含量由0.26%增加到2.49%，N元素的含量從0%增加到0.32%，證明功能單體APTES與PTMOS已經(jīng)接枝到球形硅膠上。

圖1 硅球(a)，對硫磷分子印跡聚合物(b)和非印跡聚合物(c)包覆的硅球掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of silica spheres(a),MIPs-parathion(b),NIPs-parathion(c)-coated silica spheres

2.2 對硫磷分子印跡聚合物吸附性能研究

對硫磷分子印跡聚合物吸附性能用飽和吸附容量(Q)，吸附選擇性用印跡因子(α)評價。依據(jù)公式計算Q:Q=(c0-ct)·V/m。 式中，c0和ct(mg·L-1)分別是試液的初始濃度和吸附后剩余濃度；V(mL)是試液的體積；m(mg)是吸附劑的質(zhì)量。α定義為MIPs和NIPs飽和吸附Q量之比值(QMIPs/QNIPs)。

2.2.1吸附介質(zhì)的篩選和優(yōu)化稱取10 mg對硫磷MIPs和NIPs，各3份，置于離心管中，加入10 mg·mL-1的對硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL，吸附介質(zhì)分別為PBS及含10%乙腈、含10%丙酮的PBS。室溫下振蕩5 min后，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜后，用HPLC法測定對硫磷濃度。如圖2所示，以PBS為吸附介質(zhì)時，MIPs的Q為3.32 mg·g-1，α為1.44；而含10%乙腈的PBS為吸附介質(zhì)時，MIPs的Q降為1.09 mg·g-1，α為1.48；改用含10%丙酮的PBS時，MIPs的Q為1.27 mg·g-1，而α有較大增加，達(dá)到2.11。α提高說明印跡聚合物對模板分子的非特異性吸附降低了。我們進(jìn)一步考察了PBS中丙酮含量的影響，結(jié)果顯示隨著PBS中丙酮含量的不斷增加，MIPs對模板分子的Q不斷降低，但α不斷增加，當(dāng)PBS中丙酮含量超過10%后，α便開始下降(圖3)。推測原因是隨著有機(jī)相的加入，能夠降低載體的物理吸附。因此，選擇含10%丙酮的PBS作為吸附介質(zhì)。

圖2 溶劑對分子印跡聚合物與非印跡聚合物吸附容量Q和印跡因子α的影響Fig.2 The effect of solvent on the Q and α of MIPs and NIPs

圖3 磷酸緩沖液中丙酮含量對分子印跡聚合物與非印跡聚合物吸附容量Q和印跡因子α的影響Fig.3 The effect of acetone content in the PBS on the Q and α of MIPs and NIPs

2.2.2分子印跡聚合物對對硫磷吸附性能的研究MIPs與NIPs對模板分子對硫磷的動力學(xué)吸附如圖4a所示。在前3 min，MIPs和NIPs吸附對硫磷的量增加較快，到4 min時就能達(dá)到吸附平衡。MIPs與NIPs的等溫吸附結(jié)果如圖4b所示。一定溫度下，隨著對硫磷濃度的增加，吸附容量迅速增加，當(dāng)對硫磷的濃度達(dá)到25 mg·mL-1時吸附曲線變得相對平緩。對于同一濃度的對硫磷溶液，MIPs的吸附容量明顯高于NIPs，兩者飽和吸附量分別為1.33 mg·g-1和0.63 mg·g-1。MIPs的吸附容量是NIPs的2.12倍。造成這種吸附容量差異的原因是模板分子結(jié)構(gòu)中的硝基具有強(qiáng)拉電子作用，功能單體APTES分子中含有帶孤電子對的氨基，氨基為對硫磷缺電子的硝基提供電子從而形成氫鍵；另一方面，PTMOS分子中的苯環(huán)可與對硫磷分子的苯環(huán)形成π -π共軛作用，因此該MIPs對模板產(chǎn)生了吸附作用，而NIPs由于沒有模板分子的印跡位點(diǎn)，其對模板的吸附屬于非特異性吸附。

圖4 (A)對硫磷分子在MIPs和NIPs上的動力學(xué)吸附曲線；(B)MIPs和NIPs對不同濃度的對硫磷的等溫吸附曲線Fig.4 (A)Curves of adsorption kinetics of MIPs and NIPs towards parathion;(B) Adsorption isotherm of parathion towards MIPs and NIPs

2.3 對硫磷分子印跡固相萃取柱洗脫條件的優(yōu)化

在3 mL的空白固相萃取小柱中放入一片10 μm的篩板，稱取MIPs 100 mg，向其中加入3 mL甲醇，攪勻后倒入空白固相萃取小柱中，抽干后，再放一片10 μm的篩板，將聚合物壓緊壓實，得到對硫磷分子印跡聚合物固相萃取(MISPE)小柱。NISPE小柱的制法與其相同，只是填料為NIPs。MISPE的吸附能力與制備的反應(yīng)溶劑和固相萃取中使用的溶劑類型有關(guān)。為了優(yōu)化MISPE的洗脫條件，先選擇3 mL 二氯甲烷、四氫呋喃、丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、乙酸乙酯和水分別作為淋洗溶劑，收集洗脫液用HPLC法測定，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，丙酮作為淋洗溶劑，MISPE柱對模板分子的保留能力最強(qiáng)，模板分子在MIPs和NIPs上的淋洗回收率分別為10.8%和57.4%。乙醇為洗脫溶劑時，吸附在印跡柱和非印跡柱上的模板分子的保留都是最弱的，印跡柱和非印跡柱上的模板分子的洗脫回收率分別為83.5%和108%，乙醇幾乎可以將非印跡柱上的模板分子完全洗脫下來，這樣可以彌補(bǔ)丙酮對非印跡柱洗脫能力的不足。另外，乙酸乙酯、乙腈和甲醇的淋洗和洗脫性能相似。模板分子在印跡柱和非印跡柱上的保留體現(xiàn)了印跡聚合物對模板分子的選擇性吸附，因此最終選擇丙酮作為淋洗溶劑，乙醇作為洗脫溶劑。

2.4 對硫磷分子印跡固相萃取柱對模板分子及其相似物的選擇性吸附

進(jìn)一步考察分子印跡固相萃取小柱對模板分子的選擇性，研究了MISPE柱和NISPE柱對模板對硫磷及其結(jié)構(gòu)相似物對氧磷、三唑磷和喹硫磷的吸附。從圖6中可以看出，MISPE柱對對硫磷具有較好的選擇性吸附，印跡因子α大于2.0；而MISPE柱和NISPE柱對農(nóng)藥對氧磷、三唑磷和喹硫磷的吸附能力相近，說明MISPE柱對上述3種有機(jī)小分子沒有特異性識別性能。

圖5 8種溶劑對模板分子在分子印跡固相萃取柱與非印跡固相萃取柱上的淋脫回收率Fig.5 The elution of eight solvents towards template in the MISPE and NISPE columns

圖6 分子印跡固相萃取柱和非印跡固相萃取柱對模板分子及其相似物的吸附Fig.6 The adsorption of template and structure analogues in the MISPE and NISPE columns

圖7 西紅柿空白樣品(A)和添加10 μg·kg-1對硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(B)直接分析以及經(jīng)過固相萃取后用HPLC分析的色譜圖Fig.7 Chromatograms of tomato samples with blank(A) and spiked parathion of 10 μg·kg-1(B) through direct analysis and after enrichment of SPE

2.5 對硫磷分子印跡固相萃取柱對西紅柿中對硫磷的富集研究

將MISPE柱應(yīng)用于西紅柿樣品中對硫磷的富集，收集洗脫液，定容后用HPLC法測定。MISPE結(jié)合HPLC方法的線性范圍為0.10～20.0 mg·L-1，檢測限(3σ)為0.097 mg·L-1，定量限為0.32 mg·L-1(10倍信噪比)。

為了驗證MISPE結(jié)合HPLC法測定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的可靠性，在西紅柿樣品中添加不同濃度的對硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其回收率，在10.0、25.0和50.0 μg·kg-1添加水平下，所添加的三個濃度分別為國家標(biāo)準(zhǔn)的1/10、1/4和1/2，用MISPE柱富集樣品中對硫磷，其回收率分別為41.5±4.8%、55.8±7.2%和76.1±4.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于7.2%。萃取回收率低于文獻(xiàn)報道的以久效磷為模板的分子印跡聚合物萃取水、土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率[9]。將MISPE用于復(fù)雜樣品中痕量對硫磷的富集和檢測(圖7)，在10 μg·kg-1的添加水平上，直接HPLC法分析，對硫磷色譜峰未出現(xiàn)，經(jīng)過MISPE柱的富集分離之后，對硫磷能夠被HPLC法檢測，而空白樣品中則沒有對硫磷農(nóng)藥殘留。

3 結(jié)論

本文以球形硅膠為載體，對硫磷為模板分子，氨丙基三乙氧基硅烷和苯基三甲氧基硅烷為雙功能單體，四乙氧基硅烷為交聯(lián)劑，無水乙醇為溶劑，用溶膠-凝膠法制備了對硫磷分子印跡聚合物。結(jié)果表明,對硫磷分子印跡聚合物對模板分子具有高的吸附容量，動力學(xué)響應(yīng)快，選擇識別性能良好。以制備的分子印跡聚合物為吸附劑裝填固相萃取小柱，結(jié)合HPLC法用于西紅柿中對硫磷殘留的分析檢測，方法回收率可達(dá)76.1%，有望應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的分析檢測。