， ，

(1.齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江肇東市第二中學(xué)，黑龍江綏化 151100)

對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物(Parabens)亦稱尼泊金酯[1]，通常包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯(MP)、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(EP)、對(duì)羥基苯甲酸丙酯(PP)和對(duì)羥基苯甲酸丁酯(BP)。該類化合物由于其化學(xué)穩(wěn)定性好、抗菌活性強(qiáng)、pH應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在食品、化妝品及醫(yī)藥等行業(yè)用作防腐劑。但對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物具有弱雌激素活性作用[2]，長(zhǎng)期使用危害人體健康。中國(guó)化妝品衛(wèi)生規(guī)范(2007版)[3]中規(guī)定：?jiǎn)我粚?duì)羥基苯甲酸酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不應(yīng)超過(guò)0.4%，混合酯的總量不可超過(guò)0.8%。因此，對(duì)化妝品中對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)尤為重要。

化妝品中成分復(fù)雜，其前處理手段[4]如液液萃取、固相萃取和固相微萃取等選擇性較低。將分子印跡聚合物(MIPs)與固相萃取相結(jié)合，可選擇性富集對(duì)羥基苯甲酸酯，但目前多數(shù)研究?jī)H限于對(duì)一種對(duì)羥基苯甲酸酯富集[5 - 7]，限制了其在實(shí)際樣品中的應(yīng)用。因此，建立一種同時(shí)富集與檢測(cè)化妝品中對(duì)羥基苯甲酸酯的方法具有重要意義。本文采用分子印跡技術(shù)，以對(duì)羥基苯甲酸丁酯為模板分子，采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)自由基聚合[8 - 9]與沉淀聚合相結(jié)合，制備了分子量分布窄、粒徑均一，并且對(duì)對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物具有組選擇性的MIPR微球，將該微球用作固相萃取材料，結(jié)合高效液相色譜分析，測(cè)定化妝品中對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY高效液相色譜儀(Waters科技有限公司)；TΜ-1901型紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；S-4300型掃描電子顯微鏡(日本，Hitachi公司)。

對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物(MP、EP、PP、BP)、檸檬酸(CA)、苯甲酸(BA)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；α-甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)，天津市科密歐化學(xué)試劑中心；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；氯化芐，Sigma試劑有限公司；偶氮二異丁腈(AIBN)，北京化工廠。以上試劑均為分析純。甲醇、乙腈為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑中心。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)沉淀聚合法制備分子印跡聚合物

1.2.1RAFT試劑二芐基三硫代酯的制備參考文獻(xiàn)方法[10]，采用相轉(zhuǎn)移催化法制備二芐基三硫代酯(DBTTC)。

1.2.2分子印跡聚合物的制備準(zhǔn)確稱取模板分子BP 0.0971 g(0.5 mmol)與功能單體AM 0.1422 g(2 mmol)加入到20 mL乙腈中，超聲30 min使其均勻分散，室溫下預(yù)組裝12 h；加入1.19 g(6 mmoL)交聯(lián)劑EDMA、0.03 g引發(fā)劑AIBN和RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑(DBTTC)0.1 g，超聲溶解后，充氮除氧，置于60 ℃ 水浴鍋中聚合24 h，真空抽濾獲得聚合物；用甲醇∶乙酸(9∶1，V/V)溶液洗至無(wú)BP檢出，用甲醇抽濾，洗去過(guò)量乙酸，真空干燥，得到分子印跡聚合物(MIPR)。非印跡聚合物(NIPR)除不加模板分子外，步驟同上。按上述步驟不加RAFT試劑，制備傳統(tǒng)印跡聚合物(MIPT)與傳統(tǒng)非印跡聚合物(NIPT)。

1.3 分子印跡聚合物吸附性評(píng)價(jià)

1.3.1靜態(tài)等溫吸附實(shí)驗(yàn)配制不同濃度梯度BP溶液(0.02～0.2 mg/mL)，分別加入10 mg聚合物，超聲30 min后室溫靜置24 h。取上清液1 mL，0.45 μm膜過(guò)濾，高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)。

1.3.2選擇性吸附實(shí)驗(yàn)稱取5份各20 mg的MIPR與NIPR，分別加入到1.0 mg/mL的MP、EP、PP、CA、BA溶液中，靜置24 h，取上清液1 mL，0.45 μm膜過(guò)濾后，HPLC法檢測(cè)。

1.4 實(shí)際樣品分析

1.4.1固相萃取柱的制備稱取50 mg MIPR，裝填于3 mL帶有濾板的聚丙烯空柱中，制成分子印跡固相萃取(MISPE)小柱。

1.4.2化妝品樣品的處理及回收率測(cè)定稱取5.0 g市售的BB霜樣品，加入30 mL乙醇，超聲溶解30 min 后，過(guò)濾，取3 mL濾液，上樣于甲醇活化后的MISPE中，萃取后用5 mL蒸餾水淋洗，10 mL甲醇-乙酸(9∶1，V/V)洗脫，將洗脫液N2吹干，1 mL流動(dòng)相定容，0.45 μm膜過(guò)濾，HPLC法檢測(cè)。

1.4.3HPLC分析條件色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm)，流速0.5 mL/min；流動(dòng)相為乙腈；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物形貌表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)MIPT及MIPR的形貌進(jìn)行表征。如圖1所示，傳統(tǒng)沉淀法制得的MIPT粒徑大小不一，且有粘連，RAFT法制得的MIPR外貌呈均勻球形，粒徑(約為4 μm)明顯增大，且微球之間沒(méi)有粘連，更適合用于固相萃取填料。這歸功于RAFT試劑在制備微球聚合反應(yīng)中的調(diào)控作用。

圖1 聚合物掃描電鏡(SEM)圖 Fig.1 SEM images of MIPT and MIPR a.MIPT;b.MIPR.

2.2 分子印跡聚合物吸附性評(píng)價(jià)

2.2.1靜態(tài)等溫吸附采用靜態(tài)等溫吸附實(shí)驗(yàn)[12]得到4種聚合物在0.02～0.2 mg/mL線性范圍內(nèi)的吸附等溫線。如圖2所示，聚合物的吸附容量Q隨著BP濃度的增加而增加；當(dāng)BP的濃度高于0.16 mg/mL時(shí)，吸附趨于平衡，表明聚合物上的活性結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到吸附飽和。MIPR和MIPT的吸附容量(41.8 mg/g，33.5 mg/g)大于NIPR和NIPT的吸附容量(13.7 mg/g，15.7 mg/g)，這是由于分子印跡聚合物中含有與BP相匹配的印跡孔穴與相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，特異性吸附作用使吸附容量較大，而非分子印跡聚合物對(duì)模板分子的吸附?jīng)]有特異性，吸附容量較小。同時(shí)，MIPR的吸附容量高于MIPT，這是由于RAFT試劑的加入使聚合物微球粒徑分布均勻，內(nèi)部孔穴更加均勻所致，結(jié)合位點(diǎn)增多，吸附容量較高。相反，NIPR的吸附容量低于NIPT，這是由于RAFT試劑的引入，增大聚合物的粒徑，降低聚合物微球的比表面積，所以NIPR吸附容量較NIPT小。

在分子印跡中，常用Scatchard模型[13 - 14]評(píng)價(jià)MIPs的結(jié)合特性，Scatchard曲線如圖3所示。圖中有兩條線性相關(guān)的直線，擬合方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y=-26.0x+719.6，R2=0.9993和y=-3.2x+431.4，R2=0.9714。說(shuō)明在所研究的濃度范圍內(nèi)，MIPR與BP之間存在高、低兩種結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合其結(jié)構(gòu)分析，其作用力一種是酸堿作用，另一種是氫鍵作用。

圖2 MIPR、MIPT、NIPR和NIPT的吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherm of MIPR，MIPT，NIPR and NIPT

圖3 Scathard分析曲線Fig.3 Scatchard analysis plot

分別用Langmuir、Freundlich吸附等溫線模型[15]對(duì)吸附平衡數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。如果符合Langmuir吸附等溫模型，則表示聚合物表面是均勻的，只覆蓋一種吸附位點(diǎn)，是單分子層吸附。如果符合Freundlich吸附等溫模型，則聚合物對(duì)模板分子的吸附是多分子層的，且是非均一的。MIPR對(duì)BP的兩種吸附等溫線模型參數(shù)見表1，通過(guò)比較R2可以看出，印跡聚合物吸附行為與Freundlich模型更加吻合。這表明印跡聚合物的吸附過(guò)程是多層吸附，與Scatchard分析結(jié)果一致。

表1 MIPR的吸附等溫模型參數(shù)

2.2.2選擇性吸附分別選取4種尼泊金酯(MP、EP、PP和BP)，以及另外兩種化妝品中常用的物質(zhì)苯甲酸(BA)和檸檬酸(CA)作為對(duì)照品，測(cè)定MIPR的吸附選擇性。MIPR和NIPR的選擇性吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，MIPR對(duì)4種尼泊金酯均有較高的吸附容量，對(duì)模板BP的吸附容量最高，這是由于MIPR中存在與模板BP相匹配的印跡孔穴及結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)模板表現(xiàn)出較好的特異性和較高的吸附能力；對(duì)同屬于Parabens的MP、EP、PP也具有較好的吸附容量，這是因?yàn)镸P、EP、PP與BP不僅結(jié)構(gòu)相似，與聚合物相作用的位點(diǎn)也相同，所以吸附容量也較大；而對(duì)不屬于Parabens的BA、CA的吸附容量較低(17.1 mg/g、15.0 mg/g)，這是由于BA、CA與BP的分子結(jié)構(gòu)存在明顯差異，且沒(méi)有相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)，不能進(jìn)入印跡孔穴，無(wú)特異性吸附，只有物理吸附作用。而NIPR對(duì)6種物質(zhì)的吸附容量沒(méi)有明顯差異，是由于聚合物中沒(méi)有特定的孔穴，對(duì)6種物質(zhì)均只存在物理吸附，吸附容量均較小且無(wú)明顯差異。

2.3 實(shí)際樣品分析中的應(yīng)用

2.3.1方法建立將分子印跡固相萃取(MISPE)與HPLC法相結(jié)合建立分析方法，并以回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為指標(biāo)對(duì)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，MP、EP、PP、BP在0.1～10 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，R2=0.9967，對(duì)樣品中對(duì)羥基苯甲酸酯的加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果見表2。對(duì)模板分子BP的加標(biāo)回收率最高為96.0%，這是由于MIPR對(duì)BP的高吸附容量，經(jīng)洗脫液將BP洗脫后，能達(dá)到良好的分離富集效果，故回收率最高。對(duì)于同屬于尼泊金酯類的另三種酯，回收率也較高(81.5%～91.0%)，這是因?yàn)镸IPR可以結(jié)合與模板空間結(jié)構(gòu)相似的MP、EP和PP，所以對(duì)另3種酯也有較高的吸附能力。對(duì)4種尼泊金酯的檢出限為0.0185～0.0334 μg/g，定量限為0.0617～0.111 μg/g。

表2 BB霜樣品的測(cè)定結(jié)果及回收率(n=3)

圖5 BB霜樣品MISPE前后色譜圖Fig.5 Chromatograms of BB cream before and after MISPE

2.3.2實(shí)際樣品色譜圖以MIPR為固相萃取材料，對(duì)BB霜樣品中的對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物進(jìn)行富集純化，其色譜圖見圖5。由圖可知，MISPE萃取后，有效去除了基質(zhì)干擾，樣中的對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物得到明顯富集，4種酯含量在0.162～0.385 μg/g之間，符合中國(guó)化妝品衛(wèi)生規(guī)范[3]。

3 結(jié)論

采用RAFT-沉淀聚合法，制備了對(duì)羥基苯甲酸丁酯分子印跡聚合物，與傳統(tǒng)法相比該聚合物形貌規(guī)則，對(duì)模板分子的吸附能力更強(qiáng)。經(jīng)數(shù)學(xué)模型驗(yàn)證，存在兩類結(jié)合位點(diǎn)，吸附過(guò)程屬于多層吸附。選擇性吸附實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)對(duì)羥基苯甲酸酯具有良好的組選擇性。將其作為固相萃取填料結(jié)合UPLC，對(duì)BB霜樣品中的痕量MP、EP、PP、BP進(jìn)行富集分析，回收率在81.5%～96.0%之間，RSD%≤5.6%。方法檢出限和定量限均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。