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(1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074；2.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)材料與化學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430074；3.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)地質(zhì)過程與礦產(chǎn)資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074)

隨著人們生活水平的提高，糖尿病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率不斷上升，已經(jīng)成為僅次于心血管疾病、癌癥之后危害人類健康的第三大疾病[1 - 2]。糖尿病是一組以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝疾病，多數(shù)發(fā)病緩慢，癥狀相對(duì)較輕，半數(shù)以上無任何癥狀。診斷糖尿病時(shí)，常發(fā)現(xiàn)患者可能已有5～10年的病程，已存在血管并發(fā)癥，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化性心、腦血管病。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)人體血糖濃度對(duì)于糖尿病的早期診斷和治療顯得十分重要[3 - 4]。目前臨床上常以測(cè)定患者血液中血糖的濃度和糖化血紅蛋白值來診斷糖尿病及其病程。該方法是一種侵入式的測(cè)定方法，需要采集被測(cè)患者的血液，給患者帶來極大的痛苦，且操作較復(fù)雜、測(cè)試周期較長(zhǎng)，同時(shí)也存在院內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)[5 - 7]。

研究表明，糖尿病患者在血糖濃度升高前，尿液中丙酮的濃度會(huì)明顯的升高，因此通過測(cè)定尿液中的丙酮含量，有可能獲得糖尿病病程發(fā)展的相關(guān)信息，對(duì)于糖尿病的早期預(yù)警有著重要意義[8]。丙酮具有高度的揮發(fā)性和活性，在實(shí)際分析的過程中很容易損失，而且尿液基質(zhì)比較復(fù)雜，基體干擾嚴(yán)重，特別是尿液中丙酮的濃度較低時(shí)，對(duì)其進(jìn)行直接檢測(cè)存在很大的困難。目前，臨床上常用酮體粉[9]、尿十項(xiàng)分析儀檢查尿液中丙酮，根據(jù)顏色進(jìn)行診斷，檢測(cè)過程簡(jiǎn)易快速，但因?yàn)橛绊懸蛩剌^多，只能得到一個(gè)半定量結(jié)果，容易診斷為假陽性[10]。

吹掃捕集技術(shù)由于靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性化合物的富集檢測(cè)。該技術(shù)適用于液體或固體樣品中沸點(diǎn)低(<200℃)、溶解度小的揮發(fā)性或半揮發(fā)性有機(jī)物的萃取，廣泛用于食品與環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床化驗(yàn)等領(lǐng)域[11 - 13]。黃毅[14]等采用吹掃捕集/氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)方法測(cè)定尿液中的丙酮，獲得較好的效果，但只是定性方法。Liu[15]等采用吹掃捕集/GC-MS方法測(cè)定了水體中的揮發(fā)物。目前關(guān)于吹掃捕集/GC-MS定量測(cè)定尿液中丙酮的方法少見報(bào)道。本研究考慮尿液的基質(zhì)特性，引入201-二甲基硅油作為尿液消泡劑，將吹掃捕集前處理方法與GC-MS聯(lián)用，建立了一種快速、靈敏檢測(cè)尿液中丙酮含量的新方法。通過準(zhǔn)確測(cè)定糖尿病患者尿液中丙酮的含量來判斷其病程，為糖尿病的及時(shí)診斷和早期預(yù)警提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GC-MS/QP2010Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本，島津公司)；Eclips4660-Purge&TrapSampleConcentrator吹掃捕集儀(美國(guó)，0I公司)；4551自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)，0I公司)，5mL芯式吹掃管(美國(guó)，0I公司)，10#捕集阱(Texan/硅膠/碳分子篩)(美國(guó)，0I公司)；氣相色譜微量進(jìn)樣器(5μL，上海高鴿工貿(mào)有限公司)；磁力加熱攪拌器(江蘇金壇大地自動(dòng)化儀器廠)；ME235P型十萬分之一電子天平(德國(guó)，sartorius天平)；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

丙酮(色譜純)，201-二甲基硅油(分析純)，磷酸三丁酯(分析純)。水為去離子水。

糖尿病病人及正常人尿樣由中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)醫(yī)院提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

采用1000μL的移液槍，精確移取632μL丙酮溶液于500mL的容量瓶中，以去離子水稀釋至刻度，即得到濃度為1000mg/L的丙酮儲(chǔ)備溶液。采用逐步稀釋的方法，制備濃度分別為20、40、50、80、100μg/L的丙酮標(biāo)準(zhǔn)系列1，以及200、400、600、800、1000μg/L的丙酮標(biāo)準(zhǔn)系列2。所有配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液均用聚四氟乙烯膜密封，并將其放置于4℃冰箱中，避光保存。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Rtx-WAX石英毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μm，美國(guó)RESTEK公司)；載氣為高純氦氣(99.999%)，流量lmL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比為20∶1；升溫程序：初溫40℃，保持1min，以40℃/min升至200℃，保持2min。

質(zhì)譜條件：EI源：電離電壓：70eV；接口溫度280℃；離子源溫度260℃；Scan模式采集：m/z：45～100；SIM模式采集：m/z：58、43、39，以峰面積定量。吹掃捕集條件：吹掃氣體：高純氮?dú)?99.999%)；六通閥箱溫度：40℃；傳送線溫度：250℃；水管理器：100℃；吹掃管座：50℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 吹掃捕集/GC-MS條件優(yōu)化

2.1.1GC柱溫選擇適當(dāng)提高柱溫有利于加快傳質(zhì)過程、提高分析速度而改善柱效。但柱溫太高又會(huì)增大擴(kuò)散系數(shù)而降低柱效。研究中采用四種不同的程序升溫方法：(1)初始溫度45 ℃，保持2 min，然后以速率10 ℃/min，升高到最終溫度100 ℃；(2)色譜柱初始溫度45 ℃，然后以速率20 ℃/min，升高到最終溫度100 ℃；(3)色譜柱初始溫度45 ℃，然后以速率30 ℃/min，升高到最終溫度180 ℃；(4)色譜柱初始溫度40 ℃，然后以速率40 ℃/min，升高到最終溫度200 ℃，保持1 min。結(jié)果顯示：最佳升溫程序是起始溫度為40 ℃，然后以40 ℃/min的速率升到200 ℃，保持1 min。

2.1.2吹掃時(shí)間的選擇在對(duì)丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的吹掃捕集進(jìn)樣分析中，適當(dāng)增加吹掃時(shí)間可使丙酮組分能從溶液中被充分的吹掃出來并吸附在捕集阱上，因此可以提高方法的靈敏度。但其在捕集阱上存在吸附和解吸的動(dòng)態(tài)平衡，吹掃時(shí)間過大，組分又會(huì)從捕集阱中解析出來，發(fā)生穿透現(xiàn)象。為了保證丙酮分子能夠被最大程度的吹出，而又不發(fā)生穿透，在3～21 min范圍考察了吹掃時(shí)間的影響。結(jié)果表明從3 min到13 min時(shí)，丙酮峰面積急劇增大；在13 min到15 min之間變化趨勢(shì)平緩；吹掃時(shí)間大于15 min時(shí)，峰面積幾乎沒有變化，說明吹掃時(shí)間為15 min時(shí)，溶液中的丙酮已經(jīng)被吹掃完全。因此，選擇的最佳吹掃時(shí)間為15 min。

2.1.3脫附時(shí)間的選擇脫附時(shí)間太短，捕集管內(nèi)吸附的目標(biāo)物不能被充分地釋放出來，從而導(dǎo)致分析的靈敏度降低；脫附時(shí)間太長(zhǎng)，樣品分析的效率會(huì)降低。在吹掃時(shí)間為15 min前提下，分別研究了不同的脫附時(shí)間(2、4、6、8、10和12 min)，結(jié)果表明，隨著脫附時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，丙酮峰面積持續(xù)增加，在8 min后，峰面積達(dá)到最大，之后隨著時(shí)間進(jìn)一步增加，吹掃捕集丙酮峰面積幾乎不變。為了節(jié)省分析時(shí)間，選擇8 min作為丙酮脫附的最佳時(shí)間。

2.1.4烘焙時(shí)間的選擇目標(biāo)物被吹掃出的過程中不可避免的帶有水分，捕集管在捕集目標(biāo)物的同時(shí)也會(huì)吸附水分。水分殘留在捕集管中會(huì)對(duì)下一次捕集目標(biāo)物產(chǎn)生影響，因此選擇合適的烘焙時(shí)間也十分重要。在設(shè)定吹掃時(shí)間為15 min，脫附時(shí)間8 min條件下，分別設(shè)定不同的烘焙時(shí)間(2、4、6、8、10 min)，在優(yōu)化后的GC-MS條件下分析測(cè)定，結(jié)果表明，隨著烘焙時(shí)間的不斷增加，丙酮峰面積穩(wěn)定增加。在6 min后峰面積達(dá)到最大，之后隨著時(shí)間進(jìn)一步增加，丙酮峰面積變化趨勢(shì)較小，故選擇6 min作為最佳烘焙時(shí)間。

綜上，吹掃捕集/GC-MS測(cè)定丙酮溶液的優(yōu)化條件為：色譜柱初始溫度40 ℃，以速率40 ℃/min，升高到最終溫度200 ℃，保持1 min。吹掃時(shí)間為15 min，丙酮脫附時(shí)間為8 min，烘焙時(shí)間為6 min。

2.2 樣品處理

糖尿病病人尿液樣品中由于成分復(fù)雜，尤其是有些病人存在腎功能損傷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致尿液中泡沫偏多[16]。在對(duì)尿液樣品吹掃捕集的過程中，氣體吹掃時(shí)泡沫非常多，并沿著吹掃捕集管壁上升，進(jìn)入傳輸線，而致使傳輸線的不可逆污染，極端情況下還會(huì)影響色譜柱及檢測(cè)器的分離分析效率。為了克服這一缺點(diǎn)，嘗試用201-二甲基硅油、磷酸三丁酯、羥基硅油對(duì)尿液進(jìn)行消泡處理。結(jié)果表明，201-二甲基硅油、磷酸三丁酯、羥基硅油都具有一定的消泡效果，其中201-二甲基硅油消泡效果最好，對(duì)GC-MS的測(cè)定也無影響，故我們最終選擇201-二甲基硅油作為本實(shí)驗(yàn)的消泡劑。

2.3 方法分析性能

在實(shí)際樣品測(cè)定過程中，發(fā)現(xiàn)糖尿病病人和正常人尿液中的丙酮含量存在較大的差別，因此配制了兩個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列的丙酮溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)系列1濃度分別為20、40、50、80、100、200 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)系列2濃度分別為200、400、600、800、1 000 μg/L。在最佳色譜條件下進(jìn)行分析，以峰面積的平均值(Y)對(duì)丙酮濃度(X，μg/L)作線性回歸，結(jié)果該方法在20～1 000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.99)；用優(yōu)化后的條件于1 d內(nèi)5次重復(fù)分析濃度為100 μg/L的丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，將測(cè)量得到的峰面積代入線性回歸方程，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.73%，采用選擇離子掃描的方式，將吹掃捕集儀和GC-MS調(diào)節(jié)至最佳工作狀態(tài)，然后用本方法連續(xù)11次測(cè)定濃度為20 μg/L的丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，將測(cè)得的峰面積代入線性回歸方程，得到檢測(cè)限為13.18 μg/L。

表1 測(cè)定丙酮的線性方程、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和檢出限

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

吹掃捕集進(jìn)樣實(shí)際上測(cè)定的是從待測(cè)溶液中被氣體吹出后吸附在吸附柱上，經(jīng)加熱后脫附出來的化合物。人體尿液中除了含有大量的水分，還包含許多種其它化合物。因此，為了考察尿液體系的基體影響，我們對(duì)加標(biāo)回收率進(jìn)行分析，方法如下：取適量的正常人、血糖控制較好的糖尿病病人和血糖控制較差的糖尿病病人的尿液各3份，分別加入3種已知濃度的丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用優(yōu)化后的方法，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。每個(gè)樣本平行測(cè)定3次，結(jié)果列于表2。加標(biāo)回收率基本在87.0%～98.0%之間，可見本方法對(duì)測(cè)定人體尿液中的丙酮具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采集正常人及糖尿病患者的尿液樣品，用已經(jīng)建立的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行分析，測(cè)試結(jié)果列于表3。正常人的尿液中也可以檢測(cè)到低濃度的丙酮，由于丙酮是脂肪代謝的產(chǎn)物，正常人體尿液中也存在一定量的丙酮，但是糖尿病病人尿液中的丙酮遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人尿液中丙酮的含量。應(yīng)用吹掃捕集/GC-MS的方法測(cè)定人體尿液中的丙酮，通過比較分析糖尿病病人和正常人尿液中的丙酮含量，可以對(duì)糖尿病進(jìn)行早期初步診斷，這對(duì)糖尿病的病程診斷具有重要意義。

表3 正常人及糖尿病患者尿液中血糖值與丙酮含量

圖1 糖尿病患者的血糖值與尿液中丙酮含量的關(guān)系Fig.1 Relationship between blood-sugar value and acetone content in urine of diabetic people

2.6 血糖濃度與尿液中丙酮含量相關(guān)性研究

采用統(tǒng)計(jì)分析的方法對(duì)表3中血糖濃度和尿液中丙酮含量進(jìn)行了擬合，考察了糖尿病病人的血糖值和尿液中丙酮濃度的相關(guān)性，如圖1所示。由表3可以計(jì)算出尿液中丙酮濃度和血糖值之間的相關(guān)系數(shù)在高度顯著水平為0.998，相關(guān)性明顯。尿液中丙酮含量低于1 000 μg/L可基本診斷為正常，而當(dāng)尿液中丙酮的含量在1 000 μg/L到10 000 μg/L之間可基本診斷為糖尿病初、中期患者，尿液中丙酮含量高于10 000 μg/L的可基本診斷為糖尿病高危期患者。

3 結(jié)論

本文建立了吹掃捕集/GC-MS聯(lián)用測(cè)定人體尿液中丙酮含量的方法，該方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，能夠滿足實(shí)際尿液樣品中丙酮含量的測(cè)定。利用該方法測(cè)定得到的人體尿液中丙酮含量與人體血糖值顯著相關(guān)，因此依據(jù)尿液中的丙酮含量，就可以初步診斷糖尿病患者的病程。此方法是一種非侵入式的測(cè)定方法，不需要采集患者的血液，操作簡(jiǎn)單，測(cè)試周期短，能夠減輕患者痛苦，減少院內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)，有望應(yīng)用于糖尿病的診斷之中。