劉綿學(xué) 伏毅 鄭宇 王艷 潘琳 李華 黃敏

（1. 四川省原子能研究院輻照保藏四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610101；2. 四川省原子能研究院生物技術(shù)研究所，成都 610101）

輻照食品鑒定是指通過(guò)物理、化學(xué)及生物原理［1］對(duì)食品是否接受輻照，以及評(píng)估其接受的輻照劑量的技術(shù)方法［2］，其應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)槭称沸l(wèi)生監(jiān)督部門及檢驗(yàn)檢疫部門等［4-5］。根據(jù)Akram等［3］描述，一種理想的輻照鑒定技術(shù)，需要在輻照或其它方式處理后的細(xì)微變化中，提供輻照專屬的、敏感的、可重復(fù)的、具有劑量相關(guān)性且穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。由于輻照處理通常會(huì)造成細(xì)胞DNA的雙鏈斷裂現(xiàn)象（Double strand break，DSB）［7］，基于DSB識(shí)別的輻照鑒定方法稱為“DNA變異法”［8］。近年來(lái)研究者將熒光定量PCR（Realtime PCR）方法引入輻照鑒定［9-11］，通過(guò)完整模板留存量鑒定輻照導(dǎo)致的DNA分子損傷，具體方法為通過(guò)持家基因（House-keeping gene，HK）引物的初始循環(huán)數(shù)變化值來(lái)評(píng)估輻照劑量。該技術(shù)初期用于輻照食品中的有害微生物（金黃色葡萄球菌［12］、沙門氏菌［13］和創(chuàng)傷弧菌［11］）的滅菌效果驗(yàn)證，因發(fā)現(xiàn)輻照劑量和檢測(cè)結(jié)果存在相關(guān)性［12］，開始用于海魚的輻照鑒定工作［14］。相較于現(xiàn)行國(guó)標(biāo)“彗星DNA法”，其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量級(jí)增加，可進(jìn)行輻照劑量評(píng)估。盡管如此，該方法仍存在不足之處：（1）無(wú)假陽(yáng)性樣本鑒別功能；（2）不同樣本之間若DNA模板加入量存在差異，會(huì)干擾初始循環(huán)數(shù)與輻照劑量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。綜上，輻照鑒定中熒光定量PCR技術(shù)具有較好的發(fā)展?jié)摿Γ枰玫姆椒▋?yōu)化。

引物對(duì)應(yīng)序列分布數(shù)是決定熒光定量PCR檢測(cè)效果的重要因素之一［13］，分布數(shù)越高，檢測(cè)靈敏度越高。已有報(bào)道［15］植物基因組中逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記的重復(fù)性和特異性優(yōu)于簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)域（inter-simple sequence repeat，ISSR）和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分子標(biāo)記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD），但尚無(wú)將其應(yīng)用于輻照鑒定技術(shù)的報(bào)道。本研究將長(zhǎng)末端重復(fù)序列（Long terminal repeat，LTR）反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（Transposable Elements，TE）引物引入熒光定量PCR輻照鑒定方法，擬獲得以下優(yōu)化效果：提供假陽(yáng)性樣本甄別能力，減少因初始模板量差異導(dǎo)致的結(jié)果干擾，強(qiáng)化劑量標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系。為達(dá)到以上目標(biāo)，本研究以馬鈴薯（Solanum tuberosum）切片為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)多引物體系篩選、轉(zhuǎn)座子狀態(tài)分析、DNA損傷特征分析和劑量回歸分析等方法，探究TE引物應(yīng)用及方法優(yōu)化對(duì)該鑒定方法的優(yōu)化效果。該輻照鑒定方法的構(gòu)建與優(yōu)化，對(duì)輻照食品監(jiān)管及檢驗(yàn)檢疫相關(guān)領(lǐng)域具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇四川新鮮馬鈴薯作為實(shí)驗(yàn)材料。挑選100-200 g塊莖洗凈，統(tǒng)一切為半圓形切片（厚度約5 mm），使用透明PE食品袋真空封裝。DNA提取使用 OMEGA 公司 HP Plant DNA Kit（D2485-01）。定量PCR預(yù)混液購(gòu)自Bio-Rad公司SsoFastTMEvaGreen Super Mix，引物由北京擎科生物合成，一般分析純生化試劑購(gòu)自成都科龍化工。

主要儀器：Multipette stream電動(dòng)分液器，德國(guó)Eppendorf公司；Echotherm恒溫震蕩器，美國(guó)Torrey Pines Scientific公司；設(shè)計(jì)裝源量200萬(wàn)Ci自動(dòng)化60Co-γ射線輻照裝置；5804r離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Scandrop100核酸蛋白分析儀，德國(guó)耶拿公司；CFX-96 Real-time System，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理 加熱和凍融是非輻照DNA損傷產(chǎn)生的主要原因，為區(qū)分輻照樣本和假陽(yáng)性樣本的DNA損傷差異，采用了3種處理方式：（1）不同塊莖的馬鈴薯切片進(jìn)行Co60γ射線輻照處理，輻照劑量梯度設(shè)定為 0.5、1、2、4、6、8、10 kGy［16］，每個(gè)劑量3個(gè)切片樣本，分別使用劑量片計(jì)量每個(gè)梯度的真實(shí)劑量，樣品編號(hào)設(shè)定為A1-A21。（2）不同塊莖的馬鈴薯切片進(jìn)行95℃水浴處理，水浴時(shí)間分別為1 min、2 min和3 min，每種處理各3個(gè)重復(fù)，樣本編號(hào)H1-H9。（3）凍融處理樣本使用-40℃保存10 min后轉(zhuǎn)入20℃ 10 min，分別反復(fù)“速凍-解凍”3次、4次和6次，每種處理3個(gè)重復(fù)，樣本編號(hào)F1-F9。另取未處理馬鈴薯切片作為對(duì)照，編號(hào)為CK1-CK9。以上樣本均參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取，提取液65℃金屬浴揮發(fā)10 min，去除乙醇?xì)埩簦?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選 從Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)檢索馬鈴薯持家基因18s、12s、gapdh、actin序列，從馬鈴薯轉(zhuǎn)座子序列數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml）檢索轉(zhuǎn)座子序列l(wèi)tr1、ltr2，使用NCBI網(wǎng)站引物設(shè)計(jì)工具Primer-Blast進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和篩選（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）， 共 獲得HK引物與TE引物13對(duì)（序列來(lái)源見表2）。

參照胡廣［17］操作步驟，取DNA模板CK1，測(cè)試待測(cè)引物擴(kuò)增效率En。反應(yīng)體系為10 μL，模板0.2 μL，預(yù)混液 5 μL，引物體系（1+1）μL，每種體系4個(gè)方法學(xué)重復(fù)。PCR程序?yàn)?5.0℃ 2 min，95.0℃5 s，復(fù)性延伸60.0℃ 30 s，40次重復(fù)，95.0℃ 5 s，溶解曲線溫度范圍65-95℃，升溫速度0.5℃/5 s。

取DNA模板A19-A21和CK1-CK3，檢測(cè)待測(cè)引物的相對(duì)重復(fù)系數(shù)（Relative repeatability index，RRI）和相對(duì)輻照敏感系數(shù)（Relative sensibility index，RSI）。兩種系數(shù)的定義公式分別為RRIB=（1+En）△CT0（A，B），RSIB=（RRI-（1+En）△CTD（A，B））/D，其中△CT0（A，B）為未輻照模板中不同引物A，B間的初始循環(huán)數(shù)差值；△CTD（A，B）為輻照模板中不同引物A，B間的初始循環(huán)數(shù)差值。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，按照定義公式計(jì)算各引物模板的RRI和RSI值，并按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TE引物篩選：

（1）將初始循環(huán)數(shù)最低引物設(shè)定為參照引物，參照引物的RRI和RSI值均為1；（2）計(jì)算其余引物的RRI和RSI值，排除其中RRI＞ 512的引物；（3）選擇RSI值相同或最接近的兩個(gè)引物對(duì)作為鑒別引物組合；（4）選擇RSI值差異最大兩個(gè)引物對(duì)作為劑量評(píng)估引物組合。

1.2.3 轉(zhuǎn)座子狀態(tài)分析 參照1.2.2步驟PCR體系，分別使用輻照鑒定引物組合對(duì)未輻照馬鈴薯DNA模板CK1-CK9進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。使用“ 單樣本t檢驗(yàn)”分析結(jié)果中各組的差異性，分析選擇的轉(zhuǎn)座子序列狀態(tài)是否穩(wěn)定。

1.2.4 方法檢出限分析 參照1.2.2步驟反應(yīng)體系，分別使用獲得的篩選引物體系檢測(cè)20個(gè)未輻照馬鈴薯DNA樣本，檢測(cè)初始循環(huán)數(shù)計(jì)算空白標(biāo)準(zhǔn)偏差（循環(huán)數(shù)），參照國(guó)標(biāo)GBT5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 理化部分 總則》附錄A方法［18］計(jì)算優(yōu)化鑒定方法的檢出限。

1.2.5 DNA損傷特征分析 參照1.2.2步驟反應(yīng)體系，對(duì)輻照樣本（A1-A21）和假陽(yáng)性樣本（F1-F9、H1-H9）進(jìn)行鑒定，比較不同處理方法導(dǎo)致的DNA損傷差異。計(jì)算測(cè)試樣本的 ΔΔCTD（A，B）值（A，B為引物組合），計(jì)算公式如下：

ΔΔCTD（A，B）=（CTD（B）-CT0（B））-（CTD（A）-CT0（A））

=（CTD（B）-CTD（A））-（CT0（B）-CT0（A））

其中，CTD（A）、CTD（B）分別為處理?xiàng)l件下引物 A、B 的初始循環(huán)數(shù)平均數(shù)，（CT0（B）- CT0（A））為未處理樣本初始循環(huán)數(shù)平均數(shù)。計(jì)算樣本A1-A21，F(xiàn)1-F9、H1-H9 的 ΔΔCTD（P1，P2）、ΔΔCTD（P3，P4）值。使用縱坐標(biāo) ΔΔCTD（P1，P2）與橫坐標(biāo) ΔΔCTD（P3，P4），進(jìn)行散點(diǎn)圖分析，歸納不同處理方法的數(shù)據(jù)點(diǎn)分布特征。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有定量PCR結(jié)果均采用Bio-Rad CFX Manager 3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，使用Livak的2-ΔΔCT方法［19］進(jìn)行相對(duì)定量模板分析，使用GraphPad Prism 6.0對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 劑量測(cè)定

使用重鉻酸鉀（銀）化學(xué)劑量計(jì)測(cè)定實(shí)際劑量（誤差5%），結(jié)果如表1。除0.5 kGy與10 kGy劑量偏高外，基本符合設(shè)計(jì)劑量梯度。

表1 輻照組樣本實(shí)際劑量

2.2 引物篩選結(jié)果

參選引物的RRI、RSI值與擴(kuò)增效率結(jié)果如表2。由表2可知，TE引物中RRI值最高為L(zhǎng)TR2-5，因此將LTR2-5設(shè)定為基準(zhǔn)引物，其RRI和RSI值均設(shè)定為1。根據(jù)1.2.2篩選條件，最終篩選獲得的引物體系為：（1）樣本鑒別引物組合：P1為L(zhǎng)TR2-5，P2為 18S-8；P3為 LTR2-2，P4為 ACT-5；（2） 輻照鑒定引物組合：P5為L(zhǎng)TR2-5，P6為18S-5。其中引物L(fēng)TR2-5同時(shí)作為P1和P5。

2.3 轉(zhuǎn)座子狀態(tài)結(jié)果

如表3和表4所示，在未輻照馬鈴薯DNA樣本中，△ CT（18S-8，LTR2-5）值與△ CT（ACT-5，LTR2-2）值分別在各自組內(nèi)無(wú)明顯差異，說(shuō)明LTR2-5對(duì)應(yīng)的逆轉(zhuǎn)座子序列分布穩(wěn)定，無(wú)明顯轉(zhuǎn)座活性。

表2 供篩選引物序列及參數(shù)

2.4 方法檢出限結(jié)果

根據(jù)步驟1.2.4，P1-P2空白標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.20，方法檢出限為0.60；P1-P2空白標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.13，方法檢出限為0.39；P5-P6空白標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06，方法檢出限為0.18。

表3 模板分布頻率的穩(wěn)定性分析

表4 單樣本t檢驗(yàn)

2.5 DNA損傷特征結(jié)果

樣本A1-A21，F(xiàn)1-F9、H1-H9的數(shù)據(jù)點(diǎn)分布如圖1所示。從圖1可知，輻照組樣本（A1-A21）數(shù)據(jù)點(diǎn)的縱軸值 ΔΔCTD（P1，P2）均小于 0.60（P1-P2 方法檢出限），橫軸值 ΔΔCTD（P3，P4）均小于 0.39（P3-P4方法檢出限），不同輻照樣本中DNA損傷位點(diǎn)的相對(duì)分布頻率具有一致性，不受輻照劑量變化（1-12 kGy）的影響。相對(duì)于輻照組樣本，加熱組（H1-H9）和凍融組（F1-F9）樣本數(shù)據(jù)點(diǎn)中縱坐標(biāo)或橫坐標(biāo)值大于對(duì)應(yīng)方法檢出限，呈現(xiàn)為相對(duì)于原點(diǎn)的離散分布。根據(jù)圖1中輻照和干擾樣本數(shù)據(jù)點(diǎn)的分布規(guī)律，這種一致性差異與處理方式本身或具有高度關(guān)聯(lián)性。

圖1 輻照處理引發(fā)的DNA損傷特征

2.6 劑量回歸分析結(jié)果

樣本 CK1-CK3 與 A1-A21 的 ΔΔCTD（P5，P6）與輻照劑量D的相關(guān)性結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，輻照樣本的ΔΔCTD（P5，P6）值隨輻照劑量D增加而增加，呈正相關(guān)關(guān)系；而在ΔCTD（P5，P6）值上，呈現(xiàn)為隨劑量D增加而減小的負(fù)相關(guān)性。因此，分別使用ΔΔCTD（P5，P6）、ΔCTD（P5，P6）的 2 為底的指數(shù)函數(shù)值以及單引物L(fēng)TR2-5和18S-5的ΔCTD值，與對(duì)應(yīng)的輻照劑量進(jìn)行線性回歸分析，獲得多種劑量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 輻照劑量與循環(huán)數(shù)相關(guān)性

單獨(dú)TE引物L(fēng)TR2-5或HK引物18S-5［20］的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，R2分別為93.65%和92.45%（圖3-C）；而根據(jù)循環(huán)數(shù)差值/變化數(shù)的指數(shù)函數(shù)值獲得的線性關(guān)系均進(jìn)入顯著區(qū)間（＞99%）（圖3-A、B），其中圖3-B中使用ΔCTD值的線性關(guān)系最優(yōu)（R2=99.24%），說(shuō)明該回歸模式更符合劑量-效應(yīng)的實(shí)際對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，RSI值相同或相近的引物（LTR2-5/18S-8、LTR2-2/ACT-5）之間，其初始循環(huán)數(shù)差值的變化值保持恒定，不受輻照劑量大小影響。而RSI值差異較大的引物（LTR2-5/18S-5），其初始循環(huán)數(shù)差值的變化值與劑量D成正相關(guān)關(guān)系。因此，DNA序列本身特性的RSI值，決定了不同引物間初始循環(huán)數(shù)差值的變化值是否會(huì)隨劑量變化而變化，該結(jié)論與李文建等［21］的報(bào)道一致。

圖3 不同引物體系的劑量回歸函數(shù)

根據(jù)已知結(jié)果，熒光定量PCR輻照鑒定優(yōu)化方法可歸納為以下5個(gè)步驟：（1）檢測(cè)未輻照樣本，獲得引物（P1-P5）的循環(huán)數(shù)結(jié)果，計(jì)算 CT0（P1，P2）、CT0（P3，P4）、CT0（P5，P6）的空白標(biāo)準(zhǔn)偏差和對(duì)應(yīng)檢出限；（2）檢測(cè)梯度劑量輻照樣本，分別獲得ΔCTD（P5，P6）以2為底的指數(shù)函數(shù)值，通過(guò)回歸分析獲得該樣本“劑量-循環(huán)數(shù)差值指數(shù)函數(shù)”標(biāo)準(zhǔn)曲線；（3）檢測(cè)待優(yōu)化后鑒定體系構(gòu)成為“五引物，雙模板（輻照與未輻照）”。其中TE引物的分布數(shù)高于HK引物，這與Mrigaya和Paz等［22-23］報(bào)道相符。引物L(fēng)TR2-5對(duì)應(yīng)模板為馬鈴薯逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子酶蛋白質(zhì)假設(shè)亞基編碼序列ty3-gypsy［24］，從屬于馬鈴薯基因組中7個(gè)超級(jí)重復(fù)基因家族之一的LTR/Gypsy［25］。LTR/Gypsy基因家族的片段在所有染色體均有分布［22］，呈現(xiàn)出比HK引物更高的檢測(cè)靈敏性。研究采用2組引物（4對(duì)）進(jìn)行假陽(yáng)性甄別，排除了可能的干擾現(xiàn)象（圖1）。理論上3組（6對(duì)）引物能達(dá)到更好的假陽(yáng)性樣本辨識(shí)效果，但會(huì)大幅度降低測(cè)試通量。

研究的優(yōu)化點(diǎn)包括：（1）根據(jù)引物模板的RSI值來(lái)篩選引物，消除輻照敏感度差異對(duì)鑒定結(jié)果的影響；（2）使用高度重復(fù)的TE序列作為檢測(cè)標(biāo)記物；（3）使用引物之間的初始循環(huán)數(shù)差值來(lái)對(duì)應(yīng)輻照劑量變化，消除模板差異帶來(lái)的偏差；（4）優(yōu)化劑量線性關(guān)系中初始循環(huán)數(shù)的函數(shù)模型。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于：（1）TE引物模板分布頻率高于HK引物，提高了檢測(cè)靈敏度；（2）使用相對(duì)比例，消除了DNA模板量差異對(duì)鑒定結(jié)果的影響；（3）使用優(yōu)化后的劑量標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行劑量分析。該方法與隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA［26］（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）相比，功能上均可進(jìn)行DNA的輻照損傷鑒定［27-28］，但RAPD檢測(cè)結(jié)果為凝膠電泳譜帶，需儀器觀察，且不能辨識(shí)輻照樣本；本方法結(jié)果為初始循環(huán)數(shù)差值，可直接量化分析，操作上更為簡(jiǎn)便直觀。下一步工作中將通過(guò)構(gòu)建多重探針體系［29］，提高檢測(cè)效率，擴(kuò)大其適用范圍。

4 結(jié)論

測(cè)樣本，獲得5種引物（P1/P5、P2、P3、P4和P6）的循環(huán)數(shù)結(jié)果，計(jì)算3種引物組合的循環(huán)數(shù)差值的變化數(shù) ΔΔCTD（P1，P2）、ΔΔCTD（P3，P4）和 ΔΔCTD（P5，P6）；（4）定性鑒定 ：若樣本的 ΔΔCTD（P1，P2）、ΔΔCTD（P3，P4）其中之一大于或等于對(duì)應(yīng)檢出限，判定為假陽(yáng)性樣本；若兩個(gè)值均小于對(duì)應(yīng)檢出限，則為正常樣本；正常樣本中 ΔΔCTD（P5，P6）大于對(duì)應(yīng)檢出限的，判定為輻照樣本 ；（5）劑量分析 ：基于樣本的 ΔCTD（P5，P6）值，通過(guò)步驟2的“劑量-循環(huán)數(shù)差值指數(shù)函數(shù)”的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行劑量評(píng)估。

應(yīng)用轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列引物，對(duì)輻照鑒定定量PCR技術(shù)進(jìn)行了方法優(yōu)化，篩選得到包含轉(zhuǎn)座子引物在內(nèi)的“五引物，雙模板”的鑒定體系。該優(yōu)化方法可甄別加熱、凍融處理的假陽(yáng)性樣本，消除模板差異影響，增強(qiáng)了熒光定量PCR輻照鑒定技術(shù)的“劑量-效應(yīng)關(guān)系”。