周武先，段媛媛，游景茂，趙詩晨，盧 超 ，羅孝榮，張美德*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；2.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心中藥材研究分中心，湖北恩施 445000；3.南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京 210095；4.作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，南京 210095）

砷（As）是一種有毒的類金屬元素，其氧化物三氧化二砷（As2O3）俗稱“砒霜”。過量攝入As或長期暴露在As污染的環(huán)境中可誘發(fā)皮膚、腎臟、膀胱等器官和組織的癌變[1]，患癌幾率大幅上升[2]。我國屬于水稻種植大國，含As灌溉水的使用，導致我國南方一些水稻種植地區(qū)的As污染已經(jīng)相當嚴重[3]，而水稻根系的高效硅運輸通道使其對As的吸收大大增加[4]。世界范圍內(nèi)，特別是水稻種植區(qū)，稻米已經(jīng)成為食物鏈中As的主要來源[5-7]，因此As污染水稻土的修復工作顯得尤為重要。

目前，As污染土壤的修復主要采用物理法和化學法[8-9]，物理化學方法相對簡單，但成本較高，且容易造成二次污染[10]，因而運用高效綠色的生物方法具有重要意義。無機砷中三價砷[As（Ⅲ）]的毒性最強，并且As（Ⅲ）在多數(shù)環(huán)境下相比于五價砷[As（Ⅴ）]更難以被吸附[11-12]。在一定條件下，微生物可以將As（Ⅲ）氧化為As（Ⅴ），從而降低As的移動性和毒性[13]。好氧條件下，莫于婷等[14]篩選的砷氧化菌As-I、As-Q能高效將1.3 mmol·L-1的As（Ⅲ）氧化為As（Ⅴ），其氧化率可達99%。厭氧條件下，Zhang等[15]分離的砷氧化菌Paracoccus sp.SY能夠將1 mmol·L-1的As（Ⅲ）完全氧化，同時將As氧化與硝酸鹽還原過程進行偶聯(lián)，從中獲得能量維持自身的生長。無論在好氧還是厭氧條件下，As污染水稻土中均存在大量砷氧化菌，在As污染水稻土的修復技術中，利用微生物的As（Ⅲ）氧化作用對As污染水稻土進行修復具有潛在的應用價值[15-16]。目前有關As污染水稻土的微生物修復的研究較多，但對其修復機理的研究還較少。

水稻土在淹水的過程中，厭氧環(huán)境使土壤中的As易被活化[7，17]。在淹水條件下，水稻土孔隙水中的As（Ⅴ）含量理論上占總As的10%～30%，但研究人員發(fā)現(xiàn)水稻土淹水后孔隙水中的As（Ⅴ）含量遠超過理論值，說明水稻土淹水后As的轉化雖然以還原反應為主，但仍可能存在氧化過程[18]。本文以全國不同地區(qū)的As污染水稻土為研究對象，從中篩選砷氧化菌，并進行分離和鑒定，同時開展菌株對As（Ⅲ）的耐受性及其As氧化特性研究并模擬其在淹水條件下對As污染水稻土的修復作用，為As污染水稻土的微生物修復提供依據(jù)以及探索淹水條件下砷氧化菌修復As污染水稻土的可能機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用土壤為湖北黃石、湖南郴州、廣東汕頭等地的As污染水稻土，風干后過20目篩測定pH值，過100目篩測定總As含量，測定結果見表1。

表1 各地As污染水稻土的總As含量和pH值Table 1 Total As and pH value of different As-contaminated paddy soil

供試培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、MSM培養(yǎng)基（Mineral salts medium）、CDM培養(yǎng)基（Chemically defined medium），可參照Zhang等[15]的方法配置。所有化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

供試儀器：紫外分光光度計UV2450；高效液相電感耦合等離子色譜NexIon300X；電子分析天平BSAD4S-CW；PCR擴增儀EDC-810；微量分光光度計NanoDrop 2000c。

1.2 菌株DWY-1的生理生化特性及分子鑒定

砷氧化菌的篩選采用KMnO4檢測法[19]，選取具有代表性的砷氧化菌DWY-1作為后續(xù)研究的試驗對象，接種到LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h后進行生理生化檢測，檢測內(nèi)容包括：革蘭氏染色、V.P測定、吲哚的產(chǎn)生、硝酸鹽還原反應、水解反應（脲素、七葉靈、山梨醇）和碳源利用情況（葡萄糖、精氨酸、甘露醇、麥芽糖、蘋果酸、苯乙酸）。測定方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]。

以菌株DWY-1的總DNA作為模板，分別使用引物 27F/1492R[21]和 aoxBM1-2F/aoxBM3-2R[22]進行 16S rDNA基因和砷氧化酶基因（aioA）的擴增。將純化的目的片段送武漢奧科生物技術有限公司測序，測定的目的基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得相應的登錄號。使用Nucleotide Blast的方法將目的基因與基因庫中的序列進行比對，下載最相似菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。采用MEGA 5.1軟件中ClustalW的方法進行多序列比對，用鄰接法（Neighbor-Joining Tree）進行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支置信度由自舉分析方法（Bootstrap）檢驗，重復1000次。

1.3 菌株DWY-1的As（Ⅲ）抗性及在不同濃度As（Ⅲ）中的生長情況

配制CDM培養(yǎng)基（pH值7.0～7.4），亞砷酸鈉的濃度梯度為：0、0.5、1、2、3 mmol·L-1和5 mmol·L-1，接種菌株后30 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，測定OD600nm值。

配制含0、0.5、1.0 mmol·L-1和1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）的CDM培養(yǎng)基，將菌株DWY-1接種到含不同濃度亞砷酸鈉的CDM培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h，測定OD600nm值。

1.4 菌株DWY-1的As（Ⅲ）氧化特性

以NaHCO3為碳源（10 mmol·L-1）配制含0.5、1.0 mmol·L-1和1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）的MSM培養(yǎng)基（不添加KNO3）。接種菌株DWY-1到培養(yǎng)基中，每個濃度均設置不加菌處理作為對照，每個處理3個重復，從接種后開始，48 h內(nèi)每隔6 h測定一次As形態(tài)。

以NaHCO3為碳源（10 mmol·L-1）配制含0.5、1.0 mmol·L-1和1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）的MSM培養(yǎng)基（添加1 mmol·L-1KNO3），接種菌株DWY-1，通入N2/CO2（80∶20，V/V）的混合氣體制造厭氧環(huán)境后開始，7 d內(nèi)每隔1 d測定一次As形態(tài)。試驗結束后測定培養(yǎng)基中硝態(tài)氮的濃度（NO-3的測定采用酚二磺酸紫外分光光度法，NO-2的測定采用N－[1－萘基]－乙二胺光度法）。

1.5 菌株DWY-1對As污染水稻土的修復作用

選取黃石As污染水稻土為試驗對象，稱取50 g水稻土和50 mL的蒸餾水到100 mL的血清瓶，通入N2/CO2（80∶20，V/V）的混合氣體制造厭氧環(huán)境后放置在室溫下進行厭氧培養(yǎng)3 d。將菌株DWY-1在厭氧的MSM培養(yǎng)基（含5 mmol·L-1和10 mmol·L-1NaHCO3）中培養(yǎng)到OD600nm=0.5左右，取10 mL菌液12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用0.85%的NaCl溶液洗3遍，將菌體重懸到2 mL 0.85%的NaCl溶液中，投入到血清瓶（整個過程在微生物厭氧工作臺操作），同時準備一組不加菌液（用2 mL 0.85%的NaCl溶液代替）的處理作為陰性對照，繼續(xù)在室溫下培養(yǎng)14 d，每個處理設置4個重復。培養(yǎng)結束后將血清瓶中的懸浮液倒掉，泥漿8000 r·min-1離心10 min，上清液過 0.22 μm濾膜，立即取 1 mL 1.5 mol·L-1的 HNO3溶液加入到9 mL的濾液中保存As形態(tài)[15，23]；用0.6 mol·L-1的磷酸和 0.1 mol·L-1的抗壞血酸混合液提取吸附在水稻土底泥中的As[15，24]，離心后上清液過0.22 μm濾膜，用相同方法保存濾液，上HPLC-ICP-MS測定As形態(tài)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素（One-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（α=0.05）。使用Origin 8.1軟件作圖，TRAP軟件計算EC50。采用Primer 5.0和MEGA 5.1進行基因序列的整理和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

2 結果與分析

2.1 菌株DWY-1的分離、生理生化特性

從全國各地的As污染水稻土中共計分離出6株具有As氧化功能的菌株（表2），其中一株擴增出As氧化酶基因（aioA），命名為DWY-1。菌株DWY-1為中華根瘤菌屬（Sinorhizobium sp.），DY-1、DY-6、DY-9為短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.），ST-8、CZ-5為紅球菌屬（Rhodococcus sp.）。

由表3可知，菌株DWY-1的硝酸鹽還原呈陽性，其他反應均呈陰性。能夠利用葡萄糖、甘露醇、麥芽糖等作為碳源進行生長。綜上可得DWY-1為革蘭氏陰性菌，具有多種生長代謝途徑。

表2 菌種信息表Table 2 Information of As（Ⅲ）oxidizing bacteria

表3 菌株DWY-1的生理生化測定Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain DWY-1

將目的基因16S rDNA以及aioA提交到NCBI，在Genbank中獲得相應的序列登錄號，分別為MH253882（16S rDNA）和MH283867（aioA）。將測序得到的16S rDNA基因在NCBI上通過BLAST檢索與Genbank中的核酸序列進行比對，并下載同源性序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析（圖1A）。發(fā)現(xiàn)DWY-1與苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）及費氏中華根瘤菌（Sinorhizobium fredii）的相似性均為100%，基于菌株DWY-1的16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，其與Sinorhizobium sp.DAO10的親緣關系最近。將菌株DWY-1的As氧化酶基因aioA翻譯成氨基酸序列，在NCBI上進行比對并下載同源性較高的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1B），發(fā)現(xiàn)其與Sinorhizobium sp.KGO-5親緣關系最近，綜上認定菌株DWY-1為中華根瘤菌屬（Sinorhizobium sp.）。

2.2 菌株DWY-1的As（Ⅲ）抗性及在不同濃度As（Ⅲ）中的生長曲線

如圖2所示，菌株DWY-1培養(yǎng)24 h后，不加As處理的菌株生長狀況最佳，OD600nm達到0.449，其次為0.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理，OD600nm為 0.361，當 As（Ⅲ）的濃度達到5 mmol·L-1時，菌株DWY-1的生長受到嚴重抑制，培養(yǎng)24 h后仍處于調整期，OD600nm僅為0.014。不同濃度的As處理間均存在顯著性差異（P＜0.05）。利用TRAP軟件模擬As（Ⅲ）對菌株DWY-1的半抑制濃度，得出EC50=1.59 mmol·L-1。

經(jīng)過48 h的培養(yǎng)，DWY-1在不添加As（Ⅲ）的CDM培養(yǎng)基中生長的最好（圖3），OD600nm值達到2.02；其次為0.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理，OD600nm=1.98，兩者沒有顯著性差異。當As（Ⅲ）的濃度達到1.0 mmol·L-1時，對DWY-1的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用，且隨著As（Ⅲ）的濃度增高，調整期逐漸延長。培養(yǎng)48 h 后 1.0 mmol·L-1和 1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理的OD600nm分別為 1.68和 1.24，與0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 菌株DWY-1的As氧化特性

圖2 不同濃度As（Ⅲ）對菌株DWY-1生長的影響Figure 2 Effects of different concentrations of As（Ⅲ）on growth of strain DWY-1

圖3 菌株DWY-1在不同濃度As（Ⅲ）中的生長曲線Figure 3 Growth curves of strain DWY-1 in CDM medium containing different concentrations of As（Ⅲ）

圖1 基于16S rDNA序列（A）及砷氧化酶氨基酸序列（B）構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences（A）and aioA amino acid sequences（B）of strain DWY-1 and related sequences which were retrieved from NCBI

如圖4A所示，好氧條件下，DWY-1可以在24 h內(nèi)將0.5 mmol·L-1的As（Ⅲ）完全氧化為As（Ⅴ），36 h內(nèi)氧化1.0 mmol·L-1的As（Ⅲ），48 h內(nèi)氧化1.5 mmol·L-1的As（Ⅲ）。厭氧條件下（圖4B），DWY-1可以在4 d內(nèi)完全將0.5 mmol·L-1的As（Ⅲ）的氧化為As（Ⅴ），6 d內(nèi)氧化 1.0 mmol·L-1的 As（Ⅲ），7 d內(nèi)氧化 1.5 mmol·L-1的As（Ⅲ），無論在好氧條件下還是厭氧條件下，未加菌的對照組均未檢測到As（Ⅴ）。厭氧培養(yǎng)結束后，0.5、1.0、1.5 mmol·L-1As（Ⅲ）處理的培養(yǎng)基中剩余的 NO3-濃度分別為 0.793、0.597、0.387 mmol·L-1，NO-3的去除率分別為20.7%、40.3%以及59.7%，培養(yǎng)結束后未檢測到NO-2（圖4C）。

2.4 菌株DWY-1對As污染水稻土的修復作用

從圖5可以看出，未添加菌株DWY-1的對照組（CK）培養(yǎng)兩周后土壤孔隙水（圖5A）和土壤底泥（圖5B）中磷酸可提取態(tài)的As仍以As（Ⅲ）為主，分別為2.80 mg·L-1和 45.54 mg·kg-1，占總 As的 75.7% 和91.3%。而添加菌株DWY-1處理的土壤孔隙水和土壤底泥中磷酸可提取態(tài)的As以As（Ⅴ）為主，分別為1.73 mg·L-1和 24.37 mg·kg-1，占總砷的 69.6% 和72.8%。添加菌株DWY-1的土壤孔隙水和土壤底泥中磷酸可提取態(tài)的As（Ⅲ）含量與CK相比分別降低73.0%和80.0%，總As含量分別降低32.6%和32.9%。

3 討論

圖4 菌株DWY-1在好氧（A）和厭氧（B）條件下As氧化特性以及厭氧條件下硝態(tài)氮濃度變化（C）Figure 4 Oxidiation of As（Ⅲ）by strain DWY-1 under aerobic condition without（A）or anaerobic condition with 1 mmol·L-1as the electron acceptor（B）and nitrate removel under anaerobic condition（C）

在自然環(huán)境中，As（Ⅲ）可以被氧氣等通過化學反應緩慢的氧化為As（Ⅴ），但是在微生物的作用下，As（Ⅲ）的氧化速率大幅提高[25]。As（Ⅴ）相比于As（Ⅲ）的移動性更小，毒性更低，因此微生物介導的As氧化被認為是As污染土壤修復的主要途徑之一[16，26]。環(huán)境中存在一些微生物能夠抵抗高濃度的As，甚至可以從As（Ⅲ）氧化與As（Ⅴ）還原的過程中獲得能量用于自身生長，這些微生物在大自然中普遍存在且在As的地球化學循環(huán)過程中發(fā)揮了重要作用[27-29]。本研究從As污染水稻土中分離出一株砷氧化菌DWY-1，最高可抵抗 5.0 mmol·L-1的 As（Ⅲ）。對菌株DWY-1進行鑒定發(fā)現(xiàn)其屬于中華根瘤菌屬（Sinorhi?zobium sp.），與其親緣關系最近的菌株Sinorhizobium sp.DAO10和Sinorhizobium sp.KGO-5均具有As氧化功能，且菌株DAO10也能將厭氧As氧化與硝酸鹽還原過程進行偶聯(lián)[28]，但其對As污染水稻的修復作用尚未見報道。對菌株DWY-1的生理生化特性進行研究，發(fā)現(xiàn)菌株DWY-1為革蘭氏陰性菌，能利用多種碳源進行生長，在好氧條件下和厭氧條件下均具有As（Ⅲ）氧化功能。

有研究表明，部分砷氧化菌可通過耦合As（Ⅲ）氧化與硝酸鹽還原過程并從中獲得能量用于自身生長[15，28]。Chen等[30]通過對水稻施用不同的氮肥，發(fā)現(xiàn)氮肥的施用可以減少水稻對As的吸收，這很可能是依賴于硝酸鹽還原進行As氧化的微生物造成的。在對菌株DWY-1的As氧化特性進行研究時發(fā)現(xiàn)其在好氧條件下和厭氧條件下均具有As氧化功能，并且厭氧條件下氧化As（Ⅲ）的同時伴隨著硝酸鹽還原。厭氧培養(yǎng)結束后，培養(yǎng)基中未檢測到NO2-的存在，且的去除率與As（Ⅲ）的消耗量成正比，根據(jù)化學計量學分析，發(fā)現(xiàn)菌株DWY-1的As氧化與硝酸鹽還原過程存在如下反應：8H++H2O（實驗得出消耗的As3+和比值為2.47±0.05，與理論消耗比值2.5沒有顯著性差異），推測被還原為N2，在以往的研究中，類似的菌株已有報道[15，28]。研究表明，好氧條件下，砷氧化酶AioA位于細胞的周質空間，As（Ⅲ）經(jīng)甘油水蛋白或離子通道進入菌體細胞的周質空間后被氧化為As（Ⅴ），并釋放兩個電子，電子傳遞路徑為As（Ⅲ）傳遞兩個電子到大亞基AioA的鉬蝶呤輔因子，接著經(jīng)分子鍵傳遞給[3Fe-4S]簇，然后到小亞基AioB的[2Fe-2S]簇，再到細胞色素C蛋白AioC，最后到呼吸鏈的O2，完成整個好氧As氧化過程[31-32]。然而Rhine等[33]在厭氧砷氧化菌Sinorhizobium sp.DAO10中也擴增出As氧化酶基因（aioA），說明As氧化酶AioA可能同時負責好氧As氧化以及厭氧As氧化過程。本研究在兼性厭氧菌株DWY-1的基因組DNA中也擴增出As氧化酶基因（aioA），再次證實了這一觀點。有研究報道，厭氧條件下，反硝化細菌中的硝酸還原酶（NAR）的電子供體為醌氫類，亞硝酸還原酶（NIR）的電子供體為細胞色素Cytbc1[34]。對于菌株DWY-1能夠在厭氧條件下將As（Ⅲ）氧化與硝酸鹽還原進行偶聯(lián)，筆者提出以下猜想（圖6）：As3+傳遞電子到大亞基AioA的鉬蝶呤輔因子，然后經(jīng)分子鍵傳遞到[3Fe-4S]簇，再到小亞基AioB的[2Fe-2S]簇，此時一部分電子傳遞給醌氫類（QxHy），再傳遞到硝酸還原酶（NAR），NAR將電子傳遞給并將其還原為；另外一部分電子先傳遞給細胞色素Cytbc1，然后再傳遞到亞硝酸還原酶（NIR），在NIR的作用下接受電子并被多次還原最后生成氮氣（N2），從而完成As（Ⅲ）氧化協(xié)同硝酸鹽還原的整個過程。

水稻土中As的氧化作用可以促進土壤溶液中的五價As與鐵的氧化物或氫氧化物共沉淀，降低As的生物有效性和移動性[7，35]。在模擬菌株DWY-1修復As污染水稻土的過程中，發(fā)現(xiàn)接種菌株DWY-1處理的土壤孔隙水和土壤底泥中磷酸可提取態(tài)的總As含量相比于對照分別降低32.6%和32.9%，As（Ⅴ）占總As的百分比分別從24.2%和8.7%提高到69.6%和72.8%。推測菌株DWY-1在淹水水稻土中將As（Ⅲ）氧化成As（Ⅴ），部分As（Ⅴ）與鐵氧化物形成共沉淀，致使土壤孔隙水和土壤底泥中磷酸可提取態(tài)As的含量降低，這與李思妍等[36]的研究結果相符。根據(jù)As（Ⅲ）與硝態(tài)氮反應的方程式來看，As（Ⅲ）的氧化過程需要的硝態(tài)氮不多，且在水稻土中As是微量元素，而氮是大量元素，所以推測菌株DWY-1在氧化As（Ⅲ）的過程中，土壤會溶出一部分的硝態(tài)氮，促進了菌株DWY-1的厭氧As氧化與硝酸鹽還原過程。

在研究的過程中，還發(fā)現(xiàn)5株未擴增出As氧化酶基因但具有As氧化功能的菌株，包括嗜吡啶紅球菌（Rhodococcus pyridinivorans）、泡囊短波單胞菌（Bre?vundimonas naejangsanensis）和赤紅球菌（Rhodococcus ruber）等，推測此類微生物在As污染水稻土中大量存在且在As的氧化還原過程中扮演著重要角色。適當改善As污染水稻土中有利于此類微生物生長的因素，如添加合適的碳源、調節(jié)土壤酸堿度、鹽濃度以及添加適量的硝酸鹽[37]或種植有利于此類微生物生長的植物都可能促進土壤中的As氧化過程，從而降低土壤中As的移動性和生物有效性。

4 結論

（1）砷氧化菌DWY-1對As污染水稻土具有較強的修復作用，在淹水土壤中厭氧培養(yǎng)14 d后，添加菌株DWY-1處理的土壤孔隙水和底泥中磷酸可提取態(tài)的As（Ⅲ）含量與對照（不加菌）相比分別降低73.0%和80.0%，總As含量分別降低32.6%和32.9%，表明菌株DWY-1可作為修復As污染水稻土的潛在菌種資源。

圖5 菌株DWY-1對土壤孔隙水（A）和底泥（B）As形態(tài)的影響Figure 5 Effect of strain DWY-1 inoculation on As speciation in the soil solution（A）and the phosphoric acid-extractable fraction in a flooded soil slurry（B）

圖6 厭氧條件下As氧化與硝酸鹽還原偶聯(lián)的猜想Figure 6 Supposed process of anaerobic As（Ⅲ）oxidation coupled to denitrification

（2）菌株DWY-1在好氧和厭氧條件下均具有As氧化功能，且在厭氧培養(yǎng)過程中，As3+和NO3-存在如下反應：說明砷氧化菌DWY-1可以耦合厭氧As氧化與硝酸鹽還原并從中獲得能量用于自身生長，此過程可作為修復As污染水稻土的途徑之一。