溫 睿，王乃慧，李引麗，喬建軍，代 鋒

(1.西北大學(xué) 文化遺產(chǎn)學(xué)院/文化遺產(chǎn)研究與保護(hù)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069;2.榆林市文物保護(hù)研究所 文物保護(hù)室,榆林 719000)

根據(jù)文獻(xiàn)記載,我國古代有以酒隨葬的葬俗，最早見于《禮記雜記上》,其載:醴者,稻醴也。甕、甒、筲、衡實(shí)見間[1]。在考古發(fā)掘中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)墓葬中隨葬酒器,少數(shù)酒器中還保留有液體或固體物質(zhì)。墓葬在幾百上千年的埋葬過程中,會(huì)受到地下水、淤土等周邊環(huán)境的侵?jǐn)_,因此,酒器中的液體或固體物質(zhì)是否為酒的殘留物需要科學(xué)分析方法來鑒定。國內(nèi)、外學(xué)者對(duì)酒殘留物鑒別進(jìn)行過一些探索[2-5]。這些研究大都是通過有機(jī)酸的檢測(cè),結(jié)合考古背景來推測(cè)容器中的物質(zhì)為酒殘留物的。非揮發(fā)性有機(jī)酸是酒中重要的成味物質(zhì)，其本身具有酸味和特殊口味[6]。不同酒類的主體有機(jī)酸有差別,有一定鑒別意義。但是,除了酒以外其他物質(zhì),包括奶、醋、醬油等液體物質(zhì)均含有有機(jī)酸。雖然這些物質(zhì)盛放在酒器中的可能性較小,但仍然不能從理論上排除這種可能性，在酒器與普通盛放器皿尚未區(qū)分的時(shí)代,僅通過有機(jī)酸來鑒別酒的殘留物則更加缺乏依據(jù)。

本文試圖通過紅外光譜與高效液相色譜結(jié)合的方法[7-11],建立起一套先區(qū)分、后分析的檢測(cè)體系,通過本方法對(duì)考古出土的樣品進(jìn)行再分析。

本文檢測(cè)的考古樣品來自陜西榆林走馬梁漢墓[12]出土的3件青銅器中的液體和固體殘留物(液體殘留物編號(hào)為M2∶6，M11∶2，M11∶5L；固體殘留物編號(hào)為M11∶5S)。走馬梁漢墓位于榆林市榆陽區(qū)牛家梁鎮(zhèn)的漢代古城灘城址西南1km處的走馬梁,屬于溫帶大陸性氣候,夏季涼爽冬季嚴(yán)寒,又緊鄰毛烏素沙漠。這一環(huán)境有利于有機(jī)物的保存。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司);SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀SPD-20A紫外檢測(cè)器(日本島津公司);J&K CHEMICAL C18 WpH反向色譜柱(4.6mm×250mm,5μm,北京百靈威科技有限公司);PAX固相萃取小柱(30mg/3mL,美國安捷倫公司);Vortex Genius 3旋渦混勻器(德國IKA公司)。

溴化鉀(KBr,光譜純,天津中世沃克公司);草酸(Oxalic acid, 99%，體積分?jǐn)?shù));酒石酸(L-(+)-Tartaric acid,99%，體積分?jǐn)?shù));丙酮酸(Pyruvic acid,98%);L-(-)-蘋果酸(L-(-)-Malic acid,99%，體積分?jǐn)?shù));乳酸(L-Lactic acid,85%，體積分?jǐn)?shù));富馬酸(Fumaric acid,99%，體積分?jǐn)?shù));檸檬酸(Citric acid,99%，體積分?jǐn)?shù));琥珀酸(Succinic acid,99%，體積分?jǐn)?shù))(有機(jī)酸均購于北京百靈威科技有限公司);甲醇(CH3OH,色譜純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);磷酸氫二銨((NH4)2HPO4,分析純,天津市恒興化學(xué)試劑有限公司);磷酸(H3PO4,分析純,天津市恒興化學(xué)試劑有限公司);乙醇(C2H5OH,色譜純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

以草酸0.250mg/mL、酒石酸2.000mg/mL、蘋果酸0.300mg/mL、丙酮酸5.000mg/mL、乳酸5.000mg/mL、檸檬酸6.250mg/mL、富馬酸0.110mg/mL、琥珀酸10.000mg/mL,配制8種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。分別配制成標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,2.0%,10.0%,40.0%,100.0%(體積分?jǐn)?shù))溶液,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行分析。

1.3 樣品前處理

131樣品紅外光譜檢測(cè)前處理：考慮到殘留物均來源于青銅器中,尤其是固體殘留物銅綠色的特殊性,為防止高含量堿式碳酸銅影響到含量相對(duì)較低的有機(jī)物的檢測(cè),也為了將結(jié)果代入使用現(xiàn)代相關(guān)液體建立的判別模型,故僅對(duì)液體殘留物進(jìn)行了紅外光譜檢測(cè)。制備干燥溴化鉀壓片。久置的液體殘留物中液體和沉淀已分層,先將其漩渦震蕩0.5min,使液體和沉淀混合均勻,然后迅速以移液器移取0.2mL到溴化鉀壓片上,液體殘留物M11∶2和M11∶5各制3片,40℃下干燥20min。

132樣品有機(jī)酸檢測(cè)前處理固體:精確稱量0.50g干燥的固體殘留物,研磨后與1mL超純水混合,漩渦震蕩1min,超聲處理30min使其充分溶解,1200r/min離心5min,取上層清液,用0.45μm有機(jī)系微孔濾膜過濾,過濾后樣品溶液由淺綠變?yōu)闊o色透明,移入進(jìn)樣瓶待測(cè)。液體及沉淀:久置的樣品中液體和沉淀已分層,先將其漩渦震蕩0.5min,混合均勻,移取0.5mL至離心管內(nèi),與0.5mL超純水混合,漩渦震蕩1min,超聲處理30min,1200r/min離心5min,取上層清液。用0.45μm有機(jī)系微孔濾膜過濾,過濾后樣品溶液分別由淺綠和淺黃變?yōu)闊o色透明,移入進(jìn)樣瓶待測(cè)。

1.4 優(yōu)化的儀器工作條件

1.4.1 紅外光譜參數(shù) 波數(shù)為400～2 000cm-1;分辨率為4cm-1;掃描次數(shù)16次。

1.4.2 色譜條件 色譜柱:C18 WpH反向色譜柱(4.6mm×250mm,5μm,北京百靈威科技有限公司);柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL;自動(dòng)進(jìn)樣;流動(dòng)相:A相0.01mol/L (NH4)2HPO4-H3PO4緩沖溶液(以H3PO4調(diào)節(jié)pH值為2.7)B相100%CH3OH,v(A)∶v(B)=98∶2,等度洗脫,流動(dòng)相使用前經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾;洗脫時(shí)間12min;流速1.0mL/min;檢測(cè)波長210nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的和前處理方式的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

由于文物樣品量非常有限,所以使用標(biāo)準(zhǔn)混合溶液來測(cè)評(píng)不同溶劑和前處理方法對(duì)有機(jī)酸的提取效果。

方法a:取0.5mL體積分?jǐn)?shù)10%標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,加入0.5mL超純水,震蕩使其充分混合,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行分析。

方法b:取0.5mL體積分?jǐn)?shù)10%標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,加入0.5mL80%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液,震蕩使其充分混合,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行分析。

方法c:取0.5mL體積分?jǐn)?shù)10%標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,加入0.5mL超純水,震蕩使其充分混合,共1mL,向其中滴加一滴體積分?jǐn)?shù)3%的氨水溶液,搖勻,pH約為9，呈弱堿性。PAX小柱活化后(用 2mL 甲醇和 2mL 去二次水依次以自重過柱,流速約 0.5mL/min,使 PAX 小柱活化),立即移取1mL樣品于PAX小柱內(nèi),以流速0.3mL/min加壓過柱,然后依次以2mL去離子水,2mL甲醇淋洗,最后用1mL 5%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸-甲醇溶液洗脫,洗脫液收集,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行分析。

圖1結(jié)果顯示,水的提取效果最佳。乙醇提取的總酸峰面積雖然比較高,但是，8個(gè)峰無法實(shí)現(xiàn)良好分離,還產(chǎn)生了若干雜峰。然而，使用PAX小柱進(jìn)行前處理,有機(jī)酸損失過多,可能由于這些有機(jī)酸的平均電離常數(shù)Ka較大。當(dāng)樣品體積較大時(shí),固相萃取才能起到富集的效果。鑒于文物樣品的體積有限，而且其中有機(jī)酸含量低的特點(diǎn),PAX小柱前處理不宜用于文物樣品中的有機(jī)酸檢測(cè)。

圖1 3種提取方法的提取結(jié)果Fig.1 3 methods of extraction

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 紅外光譜法判別模型 選取了不同液體(第一大類A),包括牛奶、醋、醬油、芝麻油、黃酒;和不同酒液(第二大類B),包括白酒、米酒、啤酒、黃酒、葡萄酒,采集光譜樣本,分別提取41個(gè)和44個(gè)特征譜峰(見附表)。為了消除不同液體化學(xué)成分濃度差異影響判別效果,采用歸一化法處理,即將上述所選波長的吸光強(qiáng)度與1 645cm-1波數(shù)所對(duì)應(yīng)的吸收強(qiáng)度做比值(所有液體樣品在1 645cm-1波數(shù)處均有紅外吸收),得到相對(duì)吸光強(qiáng)度。以特征峰的波數(shù)為自變量,相對(duì)吸光強(qiáng)度作為因變量,作為Fisher判別分析模型的判別指標(biāo),建立判別模型,如圖2。經(jīng)過模擬老化的現(xiàn)代酒的殘留物紅外光譜結(jié)果代入模型，可以實(shí)現(xiàn)正確判別[13]。

2.2.2 有機(jī)酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系 用8種有機(jī)酸的梯度濃度和其在210nm下檢測(cè)的不同強(qiáng)度響應(yīng)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.990 74～0.999 86,相關(guān)性良好,標(biāo)樣回歸方程和線性范圍見表1。

圖 2 第一大類(A)和第二大類(B)的判別模型Fig.2 2 estimating model

編號(hào)物質(zhì)平均保留時(shí)間/min線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2定量線性范圍/mg·mL-11草酸Oxalic acid, 99%2.85y=8 788 150.819 67x-264.147 540.993 180.000 50～0.250 00 2酒石酸L-(+)-Tartaric acid3.23y=1 307 759.836 07x+964.836 070.996 570.004 00～2.000 00 3丙酮酸Pyruvic acid3.75y=8 873 000.000 00x-63.000 000.996 440.000 60～0.300 00 4蘋果酸L-(-)-Malic acid4.18y=589 731.803 28x+646.508 200.995 850.010 00～5.000 00 5乳酸L-Lactic acid5.28y=332 420.655 74x-93.360 660.999 860.010 00～5.000 00 6檸檬酸Citric acid6.47y=766 685.901 64x-339.557 380.997 770.012 50～6.250 00 7富馬酸Fumaric acid7.63y=100 485 752.608 05x+2 449.393 440.990 740.000 22～0.110 00 8琥珀酸Succinic acid8.98y=418 926.229 51x-2 255.852 460.996 690.020 00～10.000 00

2.2.3 有機(jī)酸檢測(cè)的精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)1%(體積分?jǐn)?shù))有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行連續(xù)5次分析,每次進(jìn)樣記錄保留時(shí)間和峰面積,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD,8種有機(jī)酸的RSD值在0.55%～1.31%之間,表明該方法精密度良好。由于樣品量有限,不進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試和回收率實(shí)驗(yàn)。

2.3 實(shí)際樣品分析

2.3.1 樣品的紅外光譜判別 每個(gè)壓片平行測(cè)量3次,兩個(gè)樣品的光譜樣本均呈現(xiàn)良好的重復(fù)性。隨機(jī)選取M11∶2和M11∶5的各1條光譜樣品,選擇41個(gè)特征峰,歸一化處理后,作為預(yù)測(cè)集代入第一大類判別模型,如圖3。

圖3 第一大類樣品預(yù)測(cè)Fig.3 Samples in No.1 category

2個(gè)樣品點(diǎn)與酒的質(zhì)心點(diǎn)最為接近,而與牛奶、醋、芝麻油和醬油的質(zhì)心點(diǎn)有較遠(yuǎn)的距離。

圖4為隨機(jī)選取的2條樣品光譜譜圖與現(xiàn)代黃酒的光譜譜圖。在1 390，1 650，1 172cm-13個(gè)波數(shù)下均有較強(qiáng)吸收,初步判定含有一定量的酸類、酯類或羰基化合物。

圖4 樣品和黃酒的紅外光譜譜圖Fig.4 Spectrogram of samples and yellow wine

再隨機(jī)選取M11∶2和M11∶5各1條光譜樣品,選擇44個(gè)特征峰,歸一化處理后,作為預(yù)測(cè)集代入第二大類判別模型,如圖5。2個(gè)樣品點(diǎn)均落入米酒和黃酒聚集的范圍內(nèi),與米酒和黃酒的組質(zhì)心最為接近。

圖5 第二大類樣品預(yù)測(cè)Fig.5 Samples in No.2 category

通過紅外光譜識(shí)別,可以確定兩個(gè)液體樣品是酒類,而且指向中國古代的傳統(tǒng)糧食酒。

2.3.2 樣品的有機(jī)酸檢測(cè) 采用1.3節(jié)前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理,并在1.4.2節(jié)所述的色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果表明,在樣品中共檢測(cè)到7種有機(jī)酸,琥珀酸未檢測(cè)到。4個(gè)樣品在草酸保留時(shí)間范圍內(nèi)(±3%)都出現(xiàn)了高峰,超出線性定量范圍,故未進(jìn)行定量計(jì)算。3個(gè)樣品中檢測(cè)到乳酸,僅1個(gè)樣品中檢測(cè)到了酒石酸。樣品M11∶5L中檢測(cè)到的有機(jī)酸種類最多,M2∶6其次,說明酒的液態(tài)殘留物比固態(tài)殘留物保存有更多的有機(jī)酸,而且青銅器有蓋的情況更加利于酒殘留物的保存。出土酒殘留物中有機(jī)酸分析結(jié)果見表2。

4個(gè)樣品中僅1個(gè)檢測(cè)到酒石酸。酒石酸是葡萄酒的主體有機(jī)酸[9],若樣品是葡萄酒殘留物,則在乳酸尚能檢測(cè)到的情況下,酒石酸理應(yīng)出現(xiàn)而且含量應(yīng)為最高。所以，走馬梁酒殘留物原為葡萄酒的概率非常小。這與紅外光譜判別的結(jié)果相一致。

酒石酸是廣泛存在于植物中的一種有機(jī)酸。酒石酸的存在,證實(shí)了西漢時(shí)制作酒曲確實(shí)中會(huì)添加一些中草藥類植物。這與西晉嵇含的《南方草木狀》[14]和北魏賈思勰的《齊民要術(shù)》中記載的草曲制法相吻合[15]。中草藥類植物的加入,具有增加釀酒微生物的營養(yǎng),抑制雜菌生長,促進(jìn)微生物生長代謝與馴化的作用,并能產(chǎn)生特殊香味[16]。時(shí)至今日,制作黃酒小曲時(shí)仍然使用中草藥類植物[17]。中草藥類植物會(huì)向糧食酒中引入少量的酒石酸,此外,傳統(tǒng)方法制作的酒曲中除了用于糖化和酒化的優(yōu)勢(shì)菌種,也有一部分產(chǎn)酸雜菌,其產(chǎn)物就包括酒石酸。酒石酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,容易形成酒石酸鹽沉淀保留下來,在一定的條件變化下又還原成酒石酸。理論上講,酒石酸是殘留物中最有可能保留下來的物質(zhì)之一。

3個(gè)樣品中檢測(cè)到乳酸,而且含量較其他有機(jī)酸更高。乳酸是糧食酒中(包括現(xiàn)代黃酒、米酒)的主體有機(jī)酸,糧食酒制作在制備酒母時(shí),曲中的根霉、毛霉作用,能生成乳酸為主的酸,在酒化過程中乳酸桿菌和鏈球菌作用也能生成乳酸等有機(jī)酸[6]。

草酸也是糧食酒中重要的有機(jī)酸之一,含量僅次于乳酸[18],在谷物的浸泡,糖化和發(fā)酵過程中產(chǎn)生[19],通常以草酸鹽的形式存在。JiaJing WANG等人在使用離子色譜法(IC)對(duì)米家崖遺址陶器殘留物分析時(shí)檢測(cè)到草酸鹽的存在[5],認(rèn)為這是樣品陶器與酒的發(fā)酵有關(guān)的證據(jù)之一。McGovern PE也多次在考古殘留物分析中檢測(cè)到草酸及其鹽,并作為酒的標(biāo)記物之一[21-23]。本研究同樣檢測(cè)到了草酸,與前人的成果相合,但草酸作為酒的標(biāo)記物在判斷釀酒主要原料時(shí),指向性遜于酒石酸和乳酸。

樣品中檢測(cè)到的丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸4種有機(jī)酸在現(xiàn)代糧食酒中含量適中,通常低于或接近各自的閾值[8]。其具體含量隨廠家而異,比例無規(guī)律性關(guān)系[9,11,24-25],與走馬梁樣品的有機(jī)酸檢測(cè)結(jié)果相吻合。

表2 有機(jī)酸分析結(jié)果Tab.2 Analysis results of organic acids in wine residue

3 結(jié) 論

本研究通過對(duì)牛奶、醋、醬油、芝麻油、酒等各種古代常見食用液體紅外光譜的40余個(gè)特征峰進(jìn)行歸一化處理,采用Fisher判別模型實(shí)現(xiàn)對(duì)上述液體(包括老化以后的液體)的初步區(qū)分。在初步區(qū)分的基礎(chǔ)上,通過高效液相色譜進(jìn)一步對(duì)疑似酒殘留物樣品的有機(jī)酸含量進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)殘留物中有機(jī)酸的種類和含量可以推測(cè)酒的類別及釀酒原料。

采用上述方法對(duì)陜西榆林走馬梁漢墓出土的殘留物進(jìn)行分析。結(jié)果表明,走馬梁漢墓出土3件青銅器中的殘留物均為酒殘留物。這些酒是通過糧食釀造的發(fā)酵酒,釀酒的糧食種類目前無法判斷,還需進(jìn)一步研究。漢代經(jīng)過初期的休養(yǎng)生息,到漢武帝以后社會(huì)穩(wěn)定,經(jīng)濟(jì)發(fā)展,釀酒業(yè)比較興盛,這在漢墓的畫像石和畫像磚中均可以得到印證。范曄的《后漢書禮儀志下》載:東園武士執(zhí)事下明器。筲八盛,容三升……甕三,容三升……載以木桁,覆以疏布。甒二,容三升,醴一,酒一。載以木桁,覆以功布……卮八……行方酒壺八……瓦酒樽二,容五斗[26]。這表明從《禮記》成書年代至漢代,隨葬酒的習(xí)俗一直被當(dāng)作重要禮儀沿用。從現(xiàn)實(shí)層面來說,豐富的隨葬品象征著富足,避免死者在離世后遭受饑苦。同時(shí),墓前祭祀是喪葬活動(dòng)的一個(gè)重要環(huán)節(jié),飲食類隨葬品在其中充當(dāng)“道具”的角色。走馬梁漢墓不屬于高等級(jí)貴族墓葬[12],根據(jù)墓葬形制與器物判斷,屬于漢朝駐守邊塞區(qū)域的官員。在這些中層官吏的墓葬中發(fā)現(xiàn)酒殘留物,說明漢代以酒隨葬的習(xí)俗已經(jīng)從貴族走向普通官員甚至普通百姓,也從側(cè)面證明了漢代釀酒業(yè)的發(fā)達(dá)。

本文建立的酒殘留物的分析方法能有效地適用于考古出土的酒殘留物的鑒定和檢測(cè),通過對(duì)出土酒殘留物的系統(tǒng)檢測(cè),可以深入研究中國釀酒技術(shù)的發(fā)展歷程及其與社會(huì)發(fā)展的關(guān)系。