李凱峰,翟蒙恩,宋 凡,江麗青,李 捷,何萌杉,梁宏亮,金振曉,段維勛,王四旺,3

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)院,陜西 西安 710032;2.空軍軍醫(yī)大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 心血管外科,陜西 西安 710032；3.西北大學(xué) 生命科學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710069)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者在排除高血壓和冠心病的前提下,出現(xiàn)的心臟結(jié)構(gòu)改變和功能障礙,即使在血糖控制良好的糖尿病患者中亦有將近75%的發(fā)病率,是糖尿病患者發(fā)生心衰和導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。因此,對(duì)DCM病理改變和特點(diǎn)的研究,有利于闡明其發(fā)病機(jī)制,并為糖尿病患者實(shí)施心臟手術(shù)和體外循環(huán)時(shí)保護(hù)策略的優(yōu)化以及特異性保護(hù)藥物的研發(fā),提供客觀高效的病理評(píng)價(jià)方式和指標(biāo)。長(zhǎng)期高血糖對(duì)心肌組織和各級(jí)血管的損傷是DCM病理改變中最為主要且相互關(guān)聯(lián)的兩個(gè)方面[2]。但是，目前DCM的研究主要集中在炎癥、凋亡、纖維化等病理因素造成心肌損傷的特點(diǎn)和機(jī)制,而這些因素對(duì)血管病理改變的影響和作用特點(diǎn)則尚未完全闡明[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建DCM模型,重點(diǎn)關(guān)注DCM中各級(jí)血管中的炎癥、凋亡、纖維化等主要病理特點(diǎn),探索更為精準(zhǔn)的血管損傷與保護(hù)評(píng)價(jià)指標(biāo),為DCM血管損傷機(jī)制的研究和臨床相關(guān)保護(hù)策略提供理論基礎(chǔ)和新的探索思路。

1 材料和方法

1.1 材 料

成年雄性C57BL/6小鼠,體重20～25g,均由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鏈脲佐菌素(STZ, 美國(guó)Sigma公司),高糖高脂飲食(美國(guó)Dysts公司),原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)試劑盒(Roche公司),DAPI染液(美國(guó)Sigma公司),戊巴比妥鈉(北京索萊寶有限公司),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將40只成年雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組:① 正常對(duì)照組(Control組):持續(xù)正常飲食喂養(yǎng),4周時(shí)注射和DCM造模組相同劑量不含STZ檸檬酸鈉緩沖液;② DCM組:持續(xù)高糖高脂飲食喂養(yǎng),第4周時(shí)連續(xù)3天腹腔注射鏈脲佐菌素(streotozotocin, STZ,溶于pH=4.5檸檬酸鈉緩沖液中)60mg/kg·d-1,1周后測(cè)空腹血糖,血糖值≥11.1mmol/L即為造模成功。

1.2.2 心肌HE染色 迅速取出心臟,以預(yù)冷的PBS沖洗干凈,然后置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定24h。經(jīng)脫水、包埋后,垂直于心臟長(zhǎng)軸將其切成5 μm厚的切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。普通光鏡下拍照并觀察各級(jí)血管損傷情況。

1.2.3 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè) 迅速取出心臟,以預(yù)冷的PBS沖洗干凈,經(jīng)多聚甲醛溶液中固定后進(jìn)行石蠟包埋切片。常規(guī)脫蠟至水后,嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 迅速取出心臟,以預(yù)冷的PBS沖洗干凈,經(jīng)多聚甲醛溶液中固定后進(jìn)行石蠟包埋切片,切成5 μm厚的切片。將心臟組織切片進(jìn)行膠原蛋白I和膠原蛋白III的免疫組織化學(xué)染色。將切片用稀釋的0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白封閉30min;將切片用抗collagen I(1∶200，體積比)和collagen III(1∶1 000，體積比)抗體在4℃孵育過(guò)夜;用0.1 mol/L PBS洗滌3次后,切片與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗在37℃孵育30分鐘。用0.1 mol/l PBS洗滌3次后,通過(guò)用DAB HRP底物試劑盒(Vector lab,Burlingame,CA,USA)顯色來(lái)檢測(cè)collagen I和collagen III表達(dá)情況。

1.2.5 免疫熒光染色 迅速取出心臟,以預(yù)冷的PBS沖洗干凈,經(jīng)多聚甲醛溶液中固定后進(jìn)行石蠟包埋切片,切成5 μm厚的切片。將切片用稀釋的0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白封閉30min;輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜;用0.1 mol/L PBS洗滌3次后。滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min;用0.1 M PBS洗滌3次后,DAPI染液,避光室溫孵育10min;用0.1M PBS洗滌3次后,用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于Olympus FV10C-W3激光共聚焦顯微鏡(Olympus, Japan)下觀察并采集圖像。

1.2.6 EVG染色(Verhoeff’s Van Gieson, EVG)迅速取出心臟,以預(yù)冷的PBS沖洗干凈,經(jīng)多聚甲醛溶液中固定后進(jìn)行石蠟包埋切片,切成5 μm厚的切片。將切片放入v(酒精蘇木素)∶v(三氯化鐵)∶v(碘液)5∶2∶2混合成的EVG染液中,染30 min,自來(lái)水沖洗;三氯化鐵分化液稍分化一下,自來(lái)水洗一下,如此反復(fù)操作,在顯微鏡下控制分化程度,至彈力纖維呈紫黑色,背景呈灰白色近無(wú)色;將v(飽和苦味酸)∶v(酸性品紅)9∶1混合成VG染液,染1～3min,快速水洗,無(wú)水乙醇三缸快速脫水。用干凈的二甲苯透明1～5min,中性樹(shù)膠封片。普通光學(xué)顯微鏡下鏡檢,觀察各級(jí)血管形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以t檢驗(yàn)分析兩組間的差異顯著性,P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 DCM中各級(jí)血管形態(tài)結(jié)構(gòu)病變嚴(yán)重并發(fā)生纖維化

DCM小鼠心臟血管HE染色顯示,與Control組相比,各級(jí)血管結(jié)構(gòu)紊亂,血管壁明顯增厚(圖1(c),P<0.01),炎性細(xì)胞聚集浸潤(rùn)(圖1(a));Masson染色顯示糖尿病心肌病中,心肌組織中和血管纖維化顯著加重(圖1(b),圖中藍(lán)色染色部分;圖1(d),P<0.01;圖1(e),P<0.01),而血管周?chē)睦w維化程度較心肌中又顯得更為嚴(yán)重(P<0.01)。

2.2 DCM血管膠原纖維堆積,collagen III尤為顯著

DCM組心臟血管膠原纖維collagen I與collagen III免疫組化顯示,膠原纖維collagen I在血管周?chē)托募〗M織間隙中均有分布,與Control組相比有所增加,但并不顯著,且以伴隨血管壁增厚而增加為主(圖2(a));DCM組膠原纖維collagen III主要分布在心臟血管及周?chē)?較Control組增加顯著(圖2(b))。

(a)心臟切片血管HE染色(×500);(b)心臟切片血管Masson染色(×500);(c)血管壁厚度(以所觀察到最大管徑血管進(jìn)行測(cè)量分析);(d)心肌區(qū)域纖維占比;(e)血管周?chē)w維占比;*/**兩組間比較P<0.01/0.05, n=6圖1 糖尿病心肌病中各級(jí)血管形態(tài)結(jié)構(gòu)病變嚴(yán)重,纖維化顯著加重Fig.1 Vessels at all levels suffered serious pathologic changes of structural disordered with markedly aggravated fibrosis in DCM

2.3 DCM炎性細(xì)胞明顯增加,血管周?chē)跃奘杉?xì)胞浸潤(rùn)為主

DCM小鼠心臟炎性細(xì)胞巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記分子CD68與中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記分子ly6G分別與非特異性的細(xì)胞骨架微絲蛋白β-actin雙標(biāo)免疫熒光顯示,與Control組相比,DCM組中炎性細(xì)胞不論是巨噬細(xì)胞還是中性粒細(xì)胞均明顯增加(圖3(c),P<0.01;圖3(d),P<0.01;圖4(c),P<0.01),而其中以巨噬細(xì)胞的增加尤為顯著(圖3(a),黃色與白色箭頭指向處;),并且在血管壁的分布聚積的密集程度(圖3(a),白色箭頭指向處)遠(yuǎn)較心肌組織中高(圖3(a),黃色箭頭指向處;圖3(e),P<0.01);中性粒細(xì)胞在DCM中亦明顯增加(圖4(c),P<0.01黃色箭頭指向處),但較巨噬細(xì)胞增加幅度相對(duì)較小,且分布相對(duì)隨機(jī),并未出現(xiàn)在血管壁額外的富集浸潤(rùn)(圖3(b))。

2.4 DCM血管彈力纖維紊亂變形,特異性發(fā)生于血管的細(xì)胞凋亡并不顯著

EVG染色顯示,Control組血管壁結(jié)構(gòu)完整有序,管壁厚度適中,彈力纖維連貫(黑色箭頭指向處)。然而，DCM組則可見(jiàn)明顯的血管壁結(jié)構(gòu)紊亂,完整性破壞,彈力纖維斷裂(圖4(a));TUNEL凋亡染色顯示DCM中,凋亡細(xì)胞較正常組明顯增加(圖4(d),P<0.01),但凋亡細(xì)胞的分布亦相對(duì)的隨機(jī),未見(jiàn)在血管的特異性分布增加(圖4(b),黃色箭頭指向處)。

(a)心臟切片血管膠原纖維collagen I免疫組化染色(×500);(b)心臟切片血管膠原纖維collagen III染色(×500);n=6圖2 糖尿病心肌病血管膠原纖維聚積,collagen III尤為顯著Fig.2 Accumulation of collagenous fiber was increased in walls of vessels and collagen III is even more obviousin DCM

(a)心臟切片血管巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記分子CD68與細(xì)胞骨架微絲蛋白β-actin免疫熒光雙標(biāo)染色(×500);(b)心臟切片血管中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記分子Ly6G與細(xì)胞骨架微絲蛋白β-actin免疫熒光雙標(biāo)染色(×250);(c)心肌區(qū)域中巨噬細(xì)胞密度;(d)血管中巨噬細(xì)胞密度;(e)DCM組中心肌區(qū)域和血管中巨噬細(xì)胞密度;*/**兩組間比較P<0.01/0.05, n=6圖3 糖尿病心肌病炎性細(xì)胞明顯增加,血管周?chē)跃奘杉?xì)胞浸潤(rùn)為主Fig.3 Infiltrationof inflammatory cell was aggravated in DCM with more serious infiltration of macrophages in vascular walls

3 討 論

DCM是糖尿病患者的主要嚴(yán)重并發(fā)癥之一,是造成糖尿病患者死亡的主要原因。檢測(cè)其病理改變對(duì)于闡明其發(fā)病機(jī)制,指導(dǎo)和制定臨床上糖尿病患者心臟手術(shù)時(shí)的體外循環(huán)等保護(hù)策略均具有重要意義?，F(xiàn)有研究表明,高血糖狀態(tài)下誘發(fā)的炎癥、凋亡、纖維化是造成血管和心肌組織損傷和病變最為主要的因素,但目前對(duì)繼發(fā)病理因素在DCM血管病理?yè)p傷中的作用特點(diǎn)缺乏較全面的研究[2,4,6-8]。因此,深入研究和探討炎癥、凋亡、纖維化等因素在DCM血管病理改變中的作用特點(diǎn),對(duì)于精準(zhǔn)評(píng)價(jià)DCM的發(fā)生發(fā)展程度尤為重要。

血管壁增厚、結(jié)構(gòu)紊亂、炎性細(xì)胞聚集以及纖維化,是DCM血管病理改變中最為顯著的特點(diǎn)[2,4]。在研究中,DCM組心臟血管同樣明顯觀察到了以上特征,從側(cè)面驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒?同樣證明了這些病理變化在DCM血管病變中的關(guān)鍵性。在對(duì)纖維化的觀察和分析中,我們發(fā)現(xiàn)纖維化程度在DCM的心肌組織和血管中都明顯加重,而血管周?chē)把鼙诘睦w維化程度比心肌組織中更為嚴(yán)重。DCM中血管結(jié)構(gòu)和功能破壞、血管管腔狹窄、血栓形成機(jī)率增加、血液運(yùn)輸能力下降、血管壁氧/二氧化碳交換受阻,是最終導(dǎo)致心臟功能障礙的重要原因。

膠原纖維collagen I，collagen III是DCM中改變最為明顯的膠原纖維類(lèi)型[9-11],為進(jìn)一步研究DCM中血管膠原纖維堆積的特點(diǎn),本研究通過(guò)免疫組化的方法對(duì)這兩類(lèi)膠原纖維的分布和改變進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)膠原纖維collagen I在心肌組織間隙和血管壁均有較廣泛的分布,而膠原纖維collagen III則主要分布血管中。與Control組比較,DCM組心臟collagen I，collagen III均有所增加,兩者在血管壁的增加均較心肌組織更為明顯,其中以collagen III在血管壁的堆積最為突出。由此說(shuō)明,血管是DCM纖維化病理改變和損傷最為敏感的組織,而膠原纖維collagen III的堆積是其主要特征。

炎癥反應(yīng),包括炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)與炎性因子的釋放等,在DCM的病理改變中亦發(fā)揮著重要的作用。其中,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是機(jī)體局部參加炎性浸潤(rùn)、吞噬壞死細(xì)胞和病菌、釋放炎性因子最為主要的炎性細(xì)胞[10,12-14]。為進(jìn)一步探討這兩種炎性浸潤(rùn)細(xì)胞在DCM血管損傷炎癥反應(yīng)中的作用和特點(diǎn),本研究分別對(duì)巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD68、中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)志物ly6G與細(xì)胞骨架蛋白β-actin實(shí)施免疫熒光雙標(biāo)法,確定其數(shù)量變化和位置分布特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)在DCM組中,兩種炎性細(xì)胞的數(shù)量較正常組均明顯增多,其中中性粒細(xì)胞的增加幅度相對(duì)較小,且分布隨機(jī),未見(jiàn)在血管周?chē)奶禺愋苑植荚黾?而巨噬細(xì)胞的增加尤為明顯,且在血管壁中的分布密集程度較心肌組織更高。由此進(jìn)一步提示在DCM的病理性炎癥反應(yīng)中,血管是炎性細(xì)胞最先浸潤(rùn)且較為嚴(yán)重的組織,而這種浸潤(rùn)以巨噬細(xì)胞為主。

為了對(duì)DCM血管結(jié)構(gòu)的病理破壞程度進(jìn)行更深入和直觀的了解,本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于對(duì)心臟的血管彈性纖維環(huán)和結(jié)構(gòu)實(shí)施EVG染色。發(fā)現(xiàn)正常組各級(jí)血管管壁薄厚均一,結(jié)構(gòu)完整,較大血管有一層位于血管壁內(nèi)側(cè)的彈性纖維環(huán),分布連貫;而DCM組的血管壁則明顯增厚,厚薄不一,結(jié)構(gòu)紊亂,彈性纖維環(huán)參差斷裂。為進(jìn)一步確定DCM中嚴(yán)重的心臟各級(jí)的血管損傷是否與血管壁上細(xì)胞凋亡增加有關(guān),又對(duì)DCM中細(xì)胞的凋亡進(jìn)行了進(jìn)一步的觀察。細(xì)胞凋亡增加是DCM的重要病理改變之一,且在糖尿病小鼠的胸腹主動(dòng)脈病變中亦觀察到了相同的情況[15-16]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常Control組比較, DCM組心臟中凋亡的細(xì)胞明顯增加,但呈現(xiàn)出隨機(jī)分布,未見(jiàn)血管壁上額外的增加和密集。提示DCM中心臟嚴(yán)重的血管損傷與血管壁上細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯相關(guān)性,而炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化是其損傷的主要原因。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DCM的心臟各級(jí)血管病理改變明顯,尤其是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化程度較心肌組織更為嚴(yán)重。其中,血管壁纖維化膠原堆積以collagen III最為顯著,炎性細(xì)胞對(duì)血管的浸潤(rùn)以巨噬細(xì)胞為主。可見(jiàn),collagen III、巨噬細(xì)胞不僅可以作為DCM血管纖維化及炎性浸潤(rùn)程度的評(píng)價(jià)指標(biāo),而且還能夠依據(jù)collagen III的堆積和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度來(lái)客觀的評(píng)價(jià)臨床受治病人或動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的療效。