陸晨曦，韓躍虎,辛振龍,閆娟娟，李 天,韓夢珍,姬 婷,王立偉,呂德文,金振曉,楊 陽

(1.西北大學 生命科學學院,陜西 西安 710069;2.空軍軍醫(yī)大學 第一附屬醫(yī)院 心血管外科,陜西 西安 710032;3.空軍軍醫(yī)大學 基礎醫(yī)學院,陜西 西安 710032)

阿霉素(Adriamycin,ADR)屬于蒽環(huán)類抗癌藥,是目前應用最廣泛和有效的抗腫瘤藥之一[1],其主要的嚴重副作用是累積性、劑量依賴性的心肌毒性反應,可進一步發(fā)展成不可逆性心肌損傷,最終導致心力衰竭[2],嚴重限制了ADR的臨床應用。心肌細胞凋亡和壞死被認為是ADR誘導心肌病變發(fā)展過程中的主要因素,自我吞噬和細胞老化等其他細胞死亡方式也參與此過程。ADR誘導心肌細胞死亡的機制可能包括:促進氧化應激、細胞內鈣失調、線粒體損傷、DNA損傷、相關轉化因子的活化以及細胞凋亡通路紊亂等[3-4]。有關ADR誘導心臟毒性的確切機制至今未完全闡明,由于ADR的化學結構使其在代謝過程中易產生活性氧,許多研究表明氧化應激可能在其中扮演關鍵的角色[5]。因此,尋找減輕ADR誘導心肌損傷的有效物質,對促進ADR更好地應用于抗腫瘤治療以及降低ADR誘發(fā)心臟毒性的風險有十分重要的意義。

補骨脂為豆科植物補骨脂(PsoraleacorylifoliaLinn)的果實,是一種常見的中藥材。研究發(fā)現(xiàn),補骨脂中含有多種化學物質,如補骨脂酚(Bakuchiol,BAK)、補骨脂素、補骨脂定、異補骨脂素、巴庫查耳酮、補骨脂二氫黃酮甲醚等單萜酚類、香豆素類、黃酮類化合物[6]。1966年,Mehta等[7]首次從補骨脂中提取分離得到BAK。目前國內外關于BAK的研究報道日益增多,已發(fā)現(xiàn)BAK具有降糖降血脂、抗炎、抗菌、抗氧化保護肝細胞、抑癌、抗抑郁、植物雌激素等多種藥理活性,極具開發(fā)應用前景[8-10]。但是，BAK對于ADR心肌損傷是否有保護作用及其具體機制尚未見報道。本研究旨在評價BAK處理對ADR心肌細胞損傷的保護作用及其具體的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

BAK(陜西省寶雞市辰光生物科技有限公司)、二甲基亞砜(生工生物科技有限公司,上海)、MUSE細胞活力試劑盒(Merck Millipore公司,德國)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和ROS活性檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司);AMPK，p-AMPK，PGC1-α和β-actin抗體(博奧森生物科技有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);羊抗兔二抗(賽維爾生物科技有限公司);乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞ADR損傷模型建立 通過細胞實驗來模擬ADR誘導心肌損傷模型。具體操作流程如下:復蘇H9c2細胞,傳代3次,細胞融合度達到70%～80%后,將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液,給予梯度濃度的ADR處理24h,隨后使用MUSE細胞活力分析儀進行活力檢測。

1.2.2 實驗分組及給藥方式 細胞實驗分為3組,即對照組(Control組);ADR處理組(ADR組);不同濃度BAK保護組(BAK+ADR組)。BAK溶解于DMSO,ADR溶解于DMEM,對照組加入等體積的DMSO。

1.2.3 H9c2心肌細胞活力檢測 各組心肌細胞處理結束后,吸取上清液,加入胰蛋白酶消化5min,再加入10%(體積分數)血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化,離心,1 500r/min,3min,棄上清,將細胞團懸浮于2mL PBS中,根據MUSE細胞活力分析儀使用說明,吹打均勻細胞懸液,吸取20μL,加入380μL MUSE細胞活力試劑,混勻后避光孵育5min,將待檢測液置于細胞活力分析儀進行檢測。

1.2.4 H9c2心肌細胞中LDH水平檢測 處理結束后,收集細胞培養(yǎng)液上清,使用 2,4 二硝基苯肼顯色法檢測上清中LDH,檢測步驟嚴格依照LDH含量檢測試劑盒說明書進行。

1.2.5 H9c2心肌細胞中ROS含量檢測 處理結束后,棄上清,用預冷的PBS洗滌細胞,隨后嚴格按照試劑盒說明書進行ROS含量的檢測。

1.2.6 H9c2心肌細胞凋亡檢測 胰酶消化,收取實驗樣品,嚴格按照MUSE細胞活力分析儀操作說明和MUSE凋亡試劑盒說明進行檢測。

1.2.7 心肌細胞中AMPK，p-AMPK和PGC1-α蛋白表達檢測 具體操作流程如前所述[11],在電泳加樣孔內蛋白樣品經電泳、轉膜、封閉等步驟后于4℃孵育抗AMPK(體積比1∶500)，p-AMPK(體積比1∶500)，PGC1α(體積比1∶500)和β-actin(體積比1∶2 000)一抗,過夜;繼而室溫孵育相應二抗(體積比1∶5 000)1 h。使用MiNiChemi610成像系統(tǒng)檢測蛋白質條帶并使用Image J軟件定量。

1.3 統(tǒng)計分析

用GraphPad6.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數據均以均數±標準差(mean±SD)表示;差異顯著性檢驗采用單因素方差分析,比較兩組間差異用 LSD-t檢驗。P< 0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ADR處理可以引起心肌細胞損傷

不同濃度ADR損傷可顯著降低H9c2細胞活力,并呈濃度依賴性(與Control組相比,P<0.05),中當ADR濃度為2μM時,細胞活力下降約50%,損傷程度合適,將該濃度用于進一步實驗(圖1)。

A為H9c2細胞損傷后顯微鏡下照片(200×);B為細胞活力的統(tǒng)計圖。結果用mean±SD表示,n=6。* vs. Control,P<0.05;# vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05;# vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05;& vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05;@vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05;＄ vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05。圖1 不同濃度ADR損傷H9c2心肌細胞的細胞活力檢測Fig.1 Effects of ADR with different the viability of H9c2 cells

2.2 BAK處理可逆轉ADR引起的心肌細胞的活力降低

與ADR損傷組相比,不同濃度BAK可減輕H9c2細胞損傷,增加細胞活力(P<0.05),當BAK濃度為1.25μmol/L保護效果最佳(圖2)。

A為H9c2細胞損傷后顯微鏡下照片(200×);B為細胞活力的統(tǒng)計圖。結果用mean±SD表示,n=6。* vs. Control,P<0.05;# vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05;# vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05;& vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05;@vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05;＄ vs. 0.5μmol/L ADR,P<0.05。圖2 不同濃度BAK對ADR損傷后細胞活力的影響Fig.2 Effects of BAK with different concentratiorts on the cell viability injured by ADR

2.3 BAK處理可降低ADR引起的心肌細胞LDH水平

采用LDH檢測試劑盒檢測H9c2心肌細胞上清液中LDH水平。與Control組相比,ADR組心肌細胞培養(yǎng)液中LDH水平明顯上升(P<0.05),而BAK處理可逆轉此效果(圖3)。

結果用mean±SD表示,n=6。* vs. Control,P<0.05;# vs. ADR,P<0.05。圖3 BAK對ADR損傷后培養(yǎng)液中LDH水平檢測Fig.3 Effects of BAK on the LDH release in the culture medium injured by ADR

2.4 BAK處理可減輕ADR引起的心肌細胞氧化應激損傷

采用活性氧檢測試劑盒檢測H9c2心肌細胞內ROS水平。結果顯示,與Control組相比,ADR組心肌細胞內ROS水平明顯上升(P<0.05),而BAK處理可以明顯降低ADR引起的心肌細胞內ROS水平(P<0.05)。

A為熒光檢測的照片(100×);B為細胞ROS水平統(tǒng)計圖。結果用mean±SD表示,n=6。* vs. Control,P<0.05;# vs. ADR,P<0.05。圖4 BAK對ADR損傷后細胞內ROS水平的影響Fig.4 Effects of BAK on the cellular ROS level in jured by ADR

2.5 BAK處理可減輕ADR引起的心肌細胞凋亡

采用MUSE細胞活力分析儀檢測細胞的凋亡率。結果顯示,與Control組相比,ADR組心肌細胞的凋亡率顯著上升(P<0.05),而BAK處理可以明顯減輕ADR引起的心肌細胞凋亡(圖5)。

A為MUSE細胞活力分析儀檢測結果;B為細胞凋亡統(tǒng)計圖。結果用mean±SD表示,n=6。* vs. Control,P<0.05;# vs. ADR,P<0.05。圖5 BAK對ADR損傷后細胞凋亡率的影響Fig.5 Effects of bAK on the cell apoptotic rate unjured by ADR

2.6 BAK可以逆轉ADR下調的AMPK/PGC-1α信號通路相關分子蛋白水平

采用Western blot方法檢測p-AMPK，AMPK和PGC1α蛋白表達水平。與Control組相比,ADR處理可顯著下調p-AMPK和PGC1α的表達(P<0.05),BAK處理可以逆轉該作用(圖6)。

A為典型的Western blot條帶圖,B為各條帶灰度值統(tǒng)計圖。結果用mean±SD表示,n=3。* vs. Control,P<0.05;# vs. ADR,P<0.05。圖6 BAK對ADR損傷后細胞中AMPK/PGC-1α信號通路相關分子的影響Fig.6 Effects of BAK on the AMPK/PGC-12 signaling pathway in jured by ADR

3 討 論

ADR為一種蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物,可直接嵌入腫瘤細胞DNA抑制其核酸合成,從而發(fā)揮抗腫瘤活性[12]。大量的臨床實踐以及實驗研究表明,ADR在發(fā)揮抗腫瘤活性的同時可對正常細胞產生毒性作用,對機體產生不可逆的損傷。由于ADR具有易于在心肌細胞中積累的特性,其毒性作用在心肌組織中尤為明顯,并且呈現(xiàn)劑量依賴性[13]。ADR的心肌毒性作用極大地限制了其在腫瘤治療中的應用,當其累積劑量較大造成嚴重心肌損傷時還可增加腫瘤患者的死亡率[12, 14]。因此尋找有效的治療藥物緩解ADR引起的心肌損傷具有重要臨床意義。

ADR作用于心肌細胞會產生大量的ROS,這是目前被普遍研究并得到廣泛認可的毒性機制。ADR進入心肌細胞后,可利用還原型輔酶Ⅱ(NADPH) 或內皮型一氧化氮合酶(eNOS)轉變?yōu)榘膈獳DR,半醌自由基再進一步轉變成 C7 自由基[15]。該自由基十分活躍,可以和氧分子、細胞內其他分子發(fā)生作用。尤其可作用于細胞膜及各種細胞器膜上磷脂中的多價不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質過氧化,使細胞膜的結構發(fā)生改變、扭曲,并影響生物膜上功能蛋白質的位置或構型,降低膜的流動性,增加通透性,從而影響細胞膜的生物調節(jié)功能及離子轉運功能,并最終導致膜的完整性遭到破壞,造成心肌細胞損傷[16]。

值得關注的是,BAK具有多種生物學活性,如抗氧化應激、抗凋亡、抗炎、抗菌和抗老化等[17]。但是,BAK能否減輕ADR引起的心肌損傷目前尚無報道。氧化應激是造成細胞毒性的關鍵因素。正常情況下,機體內只有少量氧氣被轉化為ROS,且可以被機體內抗氧化酶及時清除。但在細胞受損后,可產生過量活性氧和活性氮,進而引起脂質、DNA 和蛋白質等過氧化[18],最終導致細胞凋亡和壞死。Adhikari[19]等針對脂質和蛋白質的氧化損傷,研究了BAK對各種氧化劑如Cl3CO2、亞油酸過氧化氫自由基、脂類自由基(LOO-)、DPPH自由基和OH-自由基等的清除活性,通過光脈沖輻解技術分析,首次證明了BAK可以通過清除自由基來發(fā)揮其抗氧化作用。本研究通過對ROS檢測發(fā)現(xiàn),ADR損傷會引起ROS的顯著上調,而BAK處理可以逆轉該作用。

LDH是存在于細胞漿內的酶,當心肌細胞受損時,細胞膜通透性增大,有的甚至導致膜破裂,由此大量釋放出LDH,并且研究發(fā)現(xiàn)LDH的釋放量隨心肌細胞損傷程度的增加而增加。因此,在體外實驗中,LDH是一個可以被信賴并且被普遍接受的損傷指標。本研究發(fā)現(xiàn)ADR對H9c2心肌細胞的LDH釋放有顯著上調的作用,而BAK可以顯著降低H9c2心肌細胞培養(yǎng)液上清中LDH的水平,證實其可緩解ADR對H9c2心肌細胞的損傷作用。

細胞凋亡是由基因控制的主動有序的死亡。心肌細胞凋亡是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展中的一個重要的病理生理基礎。研究發(fā)現(xiàn),細胞凋亡促使心臟疾病由代償期向失代償期轉化[20],此外心衰的嚴重程度與心肌細胞凋亡的程度呈正相關[21]。因此,細胞凋亡可以作為在體外實驗中檢測心臟疾病嚴重程度的一個重要指標[22]。本研究驗證了ADR可促進H9c2心肌細胞凋亡,而BAK可抑制ADR對心肌細胞凋亡的誘導。

AMPK作為機體的能量調控器,當器官出現(xiàn)異常尤其是當心臟受損后對能量需求會顯著增加[23],活化的AMPK會加速糖的攝取和脂肪酸氧化給心肌組織提供能量,并且抑制心肌細胞的凋亡,從而減輕心肌組織的損傷[11]。本研究結果顯示,ADR損傷可以降低細胞p-AMPK和其下游分子PGC1α的表達,而BAK可以逆轉此作用,提示AMPK/PGC1α通路在BAK抗ADR心肌損傷中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,ADR可對H9c2心肌細胞造成明顯損傷,并導致AMPK/PGC1α通路抑制。BAK可顯著減輕ARD引起的H9c2心肌細胞損傷,其作用與激活AMPK/PGC1α信號通路有關。