胡旭昀 吳 迪 李孟婷 陳佳佳 李曉僑 蘇 暢 陳少科 沈亦平,4,5 鞏純秀*

(1.國家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院-北京市兒科研究所醫(yī)學(xué)遺傳中心 兒科重大疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 出生缺陷遺傳學(xué)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100045; 2.國家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科 兒科重大疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 出生缺陷遺傳學(xué)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100045; 3.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院遺傳代謝中心實(shí)驗(yàn)室,南寧 530003; 4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)遺傳科(分子診斷實(shí)驗(yàn)室), 上海 200127; 5.哈佛醫(yī)學(xué)院波士頓兒童醫(yī)院遺傳科, 美國波士頓 02115)

短指(趾)畸形(brachydactyly，BD)形容指(趾)相比其他長骨或身體其他部位在比例上相對較短，是一種由于指(趾)骨、掌(跖)骨發(fā)育異常導(dǎo)致指(趾)縮短的疾病。BD可作為一種獨(dú)立的疾病出現(xiàn)(多為顯性遺傳)，也可伴隨其他畸形作為復(fù)雜綜合征(如Robinow綜合征、Rubinstein-Taybi綜合征等)出現(xiàn)[1-2]。在本研究中，對來自3個(gè)不同家系的BD患者進(jìn)行二代測序并分別鑒定出IHH基因、ROR2基因、PTHLH基因的致病性變異。3種基因的突變都較為罕見，本研究中ROR2基因變異c.2625dupC和PTHLH基因變異c.413delA豐富了BD患者基因突變譜。而IHH基因變異c.283_285delGAG與國外報(bào)道[3]家系突變位點(diǎn)一致，可作為BDA1型患者熱點(diǎn)突變進(jìn)行篩查。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究3例患者均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，于2015年10月至2016年8月以身材矮小就診于兒科內(nèi)分泌門診。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.1 家系1

家系1中，先證者，女，5歲，漢族，入院前2年家長發(fā)現(xiàn)患兒身高較同齡同性別兒童身材矮小就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院門診?；純簽榈?胎第1產(chǎn)，患兒母親孕期體健，否認(rèn)圍產(chǎn)期窒息史。足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量4 050 g，出生身長50 cm。大運(yùn)動(dòng)里程碑發(fā)育同正常兒童。智力發(fā)育正常。

父親年齡31歲，身高158 cm，手、足指/趾短、寬，與患兒手足的臨床表現(xiàn)類似。無青春期身高猛長?；純耗赣H年齡31歲，身高157 cm，16歲月經(jīng)初潮。

體格檢查：患兒體質(zhì)量12.5 kg，身高98.5 cm，身高位于同年齡同性別兒童身高標(biāo)準(zhǔn)曲線第3百分位線以下，上部量：53 cm，下部量：45.5 cm，上部量/下部量=1.16∶1。指間距92.5 cm。手、足短寬，拇指/趾短、寬，第4、5手指彎曲，遠(yuǎn)端指間皮膚皺褶缺失，中節(jié)和末節(jié)指骨短(圖1)。

實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、生物化學(xué)檢查(血電解質(zhì)，肝、腎功能，心肌酶，血脂等)、甲狀腺功能、皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、糖化血紅蛋白、性激素均正常。生長激素激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果見表1。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors 1，IGF-1)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(insulin-like growth factor-binding protein-3，IGF-BP3)結(jié)果見表2，均正常。性激素：促黃體生成激素(luteinizing hormone，LH) 0.14 IU/L，卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH) 0.89 IU/L，雌二醇(estradiol,E2)48.8 ng/L。垂體MRI未見異常，骨齡3歲。X線片示掌骨細(xì)但骨骺寬，近側(cè)指骨骨骺寬，中節(jié)和末節(jié)指骨明顯短小(圖1 D)。

圖1 家系1中先證者臨床表型Fig.1 Phenotype of proband from family 1A：whole body appearance; B：hand appearance; C：foot appearance; D：X-ray of left hand.

1.1.2 家系2

家系2中，先證者，男，8歲8個(gè)月，入院前5年余(即患兒3歲時(shí))家長發(fā)現(xiàn)其身高較同年齡、同性別兒童矮小，生長速度近1年長高3～4 cm?；純簽榈?胎第2產(chǎn)，足月剖宮產(chǎn)娩出，出生體質(zhì)量3 650 g，身長不詳，新生兒期體健。大運(yùn)動(dòng)及智力發(fā)育正常。8個(gè)月出牙，7歲換牙。

患兒父親36歲，身高156.1 cm，無明顯青春期身高猛長，手足指趾無明顯短粗?；純耗赣H35歲，身高157 cm，14～15歲月經(jīng)初潮。

體格檢查：患兒體質(zhì)量20.5 kg，身高117.5 cm，身高位于同年齡同性別兒童身高標(biāo)準(zhǔn)曲線第3百分位線以下，上部量60 cm，下部量57 cm，上部量/下部量=1.04∶1。指間距92.5 cm，拇指略寬，手足指趾骨發(fā)育無明顯異常(圖2)。

實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、生物化學(xué)檢查(血電解質(zhì)，肝、腎功能，心肌酶，血脂等)、甲狀腺功能、皮質(zhì)醇、ACTH、糖化血紅蛋白、性激素均正常。生長激素激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果見表1。IGF-1和IGF-BP3均正常(表2)。垂體MRI未見異常，骨齡5歲。X線片示指骨遠(yuǎn)端節(jié)段略短小(圖2D)。

1.1.3 家系3

家系3中，先證者，女，5歲，入院前5年(即患兒生后)家長發(fā)現(xiàn)患兒身長較同齡同性別兒童矮。入院前4年(即患兒1歲1個(gè)月時(shí))查身高66 cm，體質(zhì)量6.9 kg，未予特殊治療，囑隨診觀察，監(jiān)測患兒生長發(fā)育情況。近1年半患兒身高增長約11 cm?；純簽榈?胎第2產(chǎn)，孕足月剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量1 800 g，出生身長不詳。大運(yùn)動(dòng)里程碑發(fā)育同正常兒童。智力發(fā)育正常。出牙晚，1歲始出牙，6歲換牙。

患兒父親29歲，身高170 cm，手足指趾未見異常，15歲身高猛長；患兒母親28歲，身高161.5 cm，12歲月經(jīng)初潮。家系中患兒姑姑身高168 cm，但手指略短小(圖3)，姑姑未行基因檢測。

圖2 家系2中先證者臨床表型Fig.2 Phenotype of proband from family 2A：whole body appearance; B：hand appearance; C：foot appearance; D：X-ray of left hand.

圖3 家系3中先證者臨床表型Fig.3 Phenotype of proband from family 3A：facial appearance, the proband had thin hair, long face, arched eyebrows, tooth abnormal and microtia; B：hand appearance; C：foot appearance; D：X-ray of left hand; E：Hand appearance of the aunt of proband 3 showed mild brachydactyly.

表1 3例先證者GH-IGF1軸激素檢測結(jié)果Tab.1 Results of GH-IGF1 axis hormone tests of three patients

IGF-1：insulin-like growth factors 1;IGF-BP3：insulin-like growth factor-binding protein 3;GH：growth hormone;NA：no data.

體格檢查：患兒身高93.5 cm，體質(zhì)量11 kg，指間距90 cm。上部量51 cm，下部量42.5 cm。上部量/下部量之比=1.2∶1。第5小指彎曲。齒列不齊，牙齒數(shù)目正常，但每個(gè)牙齒都偏小(圖3 A～C)。

實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、生物化學(xué)檢查(血電解質(zhì)，肝、腎功能，心肌酶，血脂等)、甲狀腺功能、皮質(zhì)醇、ACTH、糖化血紅蛋白、性激素均正常。生長激素激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果見表1。IGF-1和IGF-BP3均正常(表2)。垂體MRI：未見異常。骨齡：4歲。X線片示指骨短粗，尤第5小指中段指節(jié)短(圖3D)。

1.2 遺傳學(xué)檢測

經(jīng)家系成員書面知情同意后，抽取先證者及其父母靜脈血各2 mL，使用德國Qiagen公司QIAamp Blood DNA Mini Kit對核心家系基因組DNA進(jìn)行提取。采用美國Agilent公司SureSelect全外顯子基因檢測試劑盒對核心家系成員全外顯子組進(jìn)行捕獲，構(gòu)建文庫在美國Illumina公司的Hiseq X Ten測序儀上進(jìn)行高通量測序，通過TGex(tgex-app.genecards.cn)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行注釋和過濾。通過美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)協(xié)會/分子病理學(xué)協(xié)會(American College of Medical Genetics and Genomics and Association for Molecular Pathology，ACMG/AMP)指南[4]對變異進(jìn)行致病性分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床隨訪

來自3個(gè)受累家系的先證者分別接受生長激素治療30個(gè)月、12個(gè)月和34.5個(gè)月，身高SDS均得到明顯改善，經(jīng)過治療后身高均已達(dá)到或接近正常水平。具體治療結(jié)果見表2。

表2 3例先證者接受生長激素治療情況Tab.2 Growth hormone treatment of three probands

IGF-1：insulin-like growth factors-1;IGF-BP3：insulin-like growth factor-binding protein 3;GH：growth hormone;SDS：standard deviation score.

2.2 遺傳學(xué)診斷

經(jīng)過二代測序分析，在家系1先證者中鑒定出一個(gè)遺傳自父親的IHH基因框內(nèi)缺失變異c.283_285delGAG(p.E95del，圖4)，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)物第95位谷氨酸殘基缺失。該變異位于1號外顯子，N端信號結(jié)構(gòu)域區(qū)域(N-terminal signaling domain)，在脊椎動(dòng)物中高度保守(圖5)。在家系2中鑒定出一個(gè)遺傳自父親的ROR2基因移碼變異c.2625dupC(p.T876fs*20)，位于9號外顯子，導(dǎo)致變異后第20位提前出現(xiàn)終止密碼子。在家系3中鑒定出遺傳自父親的PTHLH基因移碼變異c.413delA(p.K138fs*11)，位于4號外顯子，導(dǎo)致變異后第11位提前出現(xiàn)終止密碼子。

圖5 家系1先證者中鑒定出的IHH基因變異Fig.5 IHH variant identified from Family 1A：crystal structure of the Indian Hedgehog N-terminal signalling domain and the location of p.E95; B：p.E95 highly conserved in vertebrates.

3 討論

本研究中3例患兒均以矮小為主訴就診內(nèi)分泌科，其中2例父親身高<160 cm，均可診斷家族性矮小。病例1在臨床仔細(xì)查體時(shí)發(fā)現(xiàn)患兒有手指短特殊體征，患兒父親亦有相同體征。病例2、病例3患兒臨床短指表現(xiàn)不明顯，僅影像學(xué)顯示指骨短粗，故未明確診斷，利用二代測序技術(shù)，鑒定出3例患兒均為短指/趾畸形，分別為A1、B1、E2型，分子診斷為來自IHH基因、ROR2基因、PTHLH基因的突變。此3型的共同點(diǎn)均為手足短、寬，指骨短，干骺端略粗，可伴有趾指彎曲、出牙晚等特點(diǎn)。

目前與BD相關(guān)的疾病超過450種，與BD相關(guān)的基因超過250個(gè)(hpo.jax.org/app/browse/term/HP：0001156)，其中，單獨(dú)出現(xiàn)的短指畸形根據(jù)Bell分型可以分為A～E型以及相應(yīng)亞型。臨床上不同亞型表型上存在重疊現(xiàn)象，且往往會伴隨身材矮小等表型，容易被診斷為特發(fā)性矮小，常需要借助遺傳學(xué)診斷。在本研究中，對來自3個(gè)不同家系的BD患者進(jìn)行二代測序并分別鑒定出來自IHH基因、ROR2基因、PTHLH基因的致病性變異，分別診斷為BDA1型、B1型和E2型。

3種基因得突變都較為罕見，在世界范圍內(nèi)(HGMD Professional 2018.2)，IHH基因僅報(bào)道了31個(gè)變異，ROR2基因僅報(bào)道了40個(gè)變異、PTHLH基因僅報(bào)道了18個(gè)變異[1-2]。本研究中ROR2基因變異c.2625dupC(p.T876fs*20)和PTHLH基因變異c.413delA(p.K138fs*11)，豐富了BD患者基因突變譜。同時(shí)在中國人群中報(bào)道了IHH基因變異c.283_285delGAG(p.E95del)，該變異在dbSNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫以及GnomAD數(shù)據(jù)庫中均未見報(bào)道，在一荷蘭家系中曾有該變異的報(bào)道[3]，p.E95del在此家系中與5例患者存在共分離。經(jīng)過ACMG/AMP指南對變異進(jìn)行致病性分析，分類為可能致病性變異。該變異與國外家系報(bào)道[3]一致，從而證明該變異可能是BDA1型的一個(gè)熱點(diǎn)突變。對于ROR2基因和PTHLH基因的移碼突變，可能導(dǎo)致產(chǎn)物RNA通過無義介導(dǎo)的mRNA衰減機(jī)制降解或產(chǎn)生截短蛋白，因而突變等位基因活性大部分喪失。這兩例變異在dbSNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫以及GnomAD數(shù)據(jù)庫中均未見報(bào)道，提示等位基因變異人群頻率極低。人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Database，HGMD)與Clinvar數(shù)據(jù)庫中均未收錄該變異致病報(bào)道，經(jīng)過ACMG/AMP指南[4]對變異進(jìn)行致病性分析，均分類為致病性或可能致病性變異。

IHH基因位于2號染色體q35區(qū)域，編碼的印度刺猬(Indian hedgehog)蛋白特異性表達(dá)在軟骨板，指(趾)尖和生長板中的前肥大軟骨細(xì)胞。該蛋白功能涉及軟骨細(xì)胞分化、關(guān)節(jié)發(fā)育與骨形成，可在發(fā)育過程中調(diào)節(jié)骨骼的生長和骨化之間的平衡，同時(shí)可誘導(dǎo)甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白的表達(dá)[5]。

2001年， Gao等[6]首次揭示了IHH基因突變與BDA1型的關(guān)系，在3個(gè)獨(dú)立的中國大家系中，鑒定出3個(gè)N端信號結(jié)構(gòu)域區(qū)域(N-terminal signalling domain)的錯(cuò)義變異。BDA1型的特點(diǎn)是所有指(趾)的成比例縮短、指間皺褶部分缺失，并常伴隨第二、三、四指(趾)彎曲，以及拇指(趾)的近端指(趾)骨寬。X線片提示中指(趾)骨縮短或缺失、遠(yuǎn)端指(趾)骨縮短、末端指(趾)關(guān)節(jié)黏連以及近側(cè)指骨變細(xì)伴骨骺增大。第二和第五指(趾)受累最為嚴(yán)重。在嚴(yán)重受累患者中可累及整個(gè)骨骼系統(tǒng)，導(dǎo)致身材矮小。本研究家系1中患者的變異同樣位于N端信號結(jié)構(gòu)域區(qū)域，第95號氨基酸位置，該位置此前有出現(xiàn)3例不同變異的報(bào)道：p.E95K、p.E95G和p.E95del[3,6-7]，表明該高度保守的谷氨酸對于IHH信號通路的重要性，該家系患者臨床癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)典型，表明該結(jié)構(gòu)域區(qū)域位點(diǎn)變異影響功能，預(yù)測在BDA1家族中會發(fā)現(xiàn)更多的E95突變，可作為BDA1型患者熱點(diǎn)突變進(jìn)行篩查。

ROR2基因位于9號染色體q22.31區(qū)域，編碼酪氨酸蛋白激酶跨膜受體，目前研究[8]顯示其功能可能涉及軟骨細(xì)胞的早期形成，是軟骨和生長板發(fā)育所必需的受體，從而誘導(dǎo)成骨作用。2000年， Oldridge等[9]在BDB1家系中鑒定出靠近ROR2蛋白C端的2個(gè)無義變異和1個(gè)移碼變異。經(jīng)預(yù)測這些變異會導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域后的胞內(nèi)部分缺失。BDB1是短指中表型最為嚴(yán)重的一種，特點(diǎn)主要表現(xiàn)為2～5指(趾)的遠(yuǎn)端(包括指甲)和中端指(趾)節(jié)發(fā)育不良甚至缺失，同時(shí)出現(xiàn)指(趾)關(guān)節(jié)黏連、指屈曲和并指等表型。

本研究中家系2重患者所攜帶的移碼變異為世界首報(bào)，預(yù)測將產(chǎn)生缺少1個(gè)下游絲氨酸/蘇氨酸區(qū)域的截短蛋白，影響正常功能。目前研究[10-11]表明，BDB1突變多以無義或移碼變異為主，且其中大多數(shù)變異最終導(dǎo)致產(chǎn)生截短蛋白，變異位置不同引起患者表型差異較大，其中部分表型輕微患者可僅表現(xiàn)為個(gè)別手指彎曲或者個(gè)別手指指甲變小/缺失等[12]。本家系患者及其父親攜帶的變異位置靠近末端，這可能是其表型較輕微的原因之一。

PTHLH基因位于12號染色體p11.22區(qū)域，其編碼的甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白可作為內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌和胞分泌激素，是骨發(fā)育調(diào)控所必需的，維持軟骨細(xì)胞的增生、延緩軟骨細(xì)胞的進(jìn)一步分化[13]。2010年，Klopocki等[14]在4個(gè)散發(fā)的BDE2、身材矮小家系中鑒定出該基因的2個(gè)錯(cuò)義變異和2個(gè)無義變異，證明了PTHLH基因與BDE2的關(guān)系。同BDA1和BDB1不同，BDE2的患者除指(趾)骨縮短外，還可表現(xiàn)為掌骨和跖骨不同程度的縮短，以及出牙延遲或少牙畸形。本研究家系3中患者的變異c.413delA(p.K138fs*11)為世界上首次報(bào)道，可能導(dǎo)致產(chǎn)物RNA通過無義介導(dǎo)的mRNA衰減機(jī)制降解或產(chǎn)生一個(gè)截短蛋白。本研究報(bào)道的患者具有典型的身材矮小、短指畸形以及牙列不齊、牙齒偏小(圖3)。但是攜帶相同變異的父親身高卻是正常的，可能是存在著修飾基因等因素而導(dǎo)致外顯不全。目前，有報(bào)道稱攜帶PTHLH基因突變的患者中仍有約41%(14/34)具有正常身高，具體原因仍需更多研究[14-18]。

目前，對不同亞型的BD仍然沒有統(tǒng)一的治療方法。極端情況下，當(dāng)畸形嚴(yán)重影響手部正常功能時(shí)可以考慮整形手術(shù)。不同亞型的BD預(yù)后情況差異較大，最新的研究[19]成果顯示IHH突變在身材矮小患兒中占有較高比例且對生長激素治療有較好的反應(yīng)，Pereda等[15]對5例IHH突變患兒進(jìn)行生長激素治療后平均身高1年內(nèi)增長了0.6標(biāo)準(zhǔn)差。在本研究中，由于3個(gè)家系的先證者都是以身材矮小為主訴進(jìn)行就診，對3個(gè)患兒均進(jìn)行了生長激素治療，治療結(jié)果顯著，身高SDS均得到明顯改善，為合并BD的身材矮小臨床治療提供了更多依據(jù)。

綜上所述，在3例身材矮小伴BD患者中分別鑒定出來自IHH基因、ROR2基因、PTHLH基因的致病性變異，不僅明確了患者的臨床診斷及其分型，同時(shí)對臨床表型以及治療情況進(jìn)行詳細(xì)說明，從而進(jìn)一步擴(kuò)展了BD患者的突變譜和表型譜，為臨床診斷和遺傳咨詢提供了直接依據(jù)。臨床上針對家族性矮小，當(dāng)有臨床或影像學(xué)的提示時(shí)，即使癥狀不典型，亦建議BD的靶向捕獲基因檢測以進(jìn)一步明確分子病因。