衛(wèi)冬 陳麗娟 教瑩瑩 李紅玉 孫兆義

[摘要]目的 通過激活兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）內(nèi)蛋白激酶C（PKC），觀察RPE細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的表達(dá)情況以及細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）的表達(dá)水平。方法 應(yīng)用免疫熒光染色鑒定原代培養(yǎng)兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE），將第3代RPE細(xì)胞分為空白對(duì)照組（15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，n=8）、PMA組（15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液+4 μl 100 nmol/L PKC特異激活劑佛波酯溶液，n=8）和PMA+BST組（用4 μl 10 μmol/L Nrf2抑制劑鴉膽苦醇溶液預(yù)處理RPE細(xì)胞1 h后，吸出并加入含PMA 4 μl 100 nmol/L的15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，n=8），培養(yǎng)24 h后，采用Western-blot方法檢測(cè)Nrf2蛋白在胞質(zhì)和胞核內(nèi)的表達(dá)，采用GSH試劑盒檢測(cè)各組RPE細(xì)胞內(nèi)GSH的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2及細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，采用免疫熒光染色檢測(cè)Nrf2蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果 RPE細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見黑色素顆粒，呈長梭形，鼠抗人角蛋白（AE1/AE3）免疫熒光染色鑒定呈強(qiáng)陽性；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，PMA組和PMA+BST組胞質(zhì)內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)顯著減少，胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加，其中PMA組胞質(zhì)內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)較PMA+BST組顯著降低，而細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)則顯著增多（胞質(zhì)：F=26.62，P<0.05；胞核：F=29.88，P<0.05）。GSH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，PMA組和PMA+BST組細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)顯著增高，其中PMA組細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)顯著高于PMA+BST組（F=37.64，P<0.05）。細(xì)胞核內(nèi)Nrf2與細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)成正相關(guān)（R2=0.908，P<0.05）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PMA組和PMA+BST組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)增加，發(fā)生了核轉(zhuǎn)位，其中PMA組較PMA+BST組核轉(zhuǎn)位更為顯著。結(jié)論 PKC活化能夠促進(jìn)RPE細(xì)胞抗氧化能力，其作用機(jī)制與PKC/Nrf2信號(hào)通路調(diào)節(jié)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；蛋白激酶C；核因子E2相關(guān)因子2；谷胱甘肽

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）11（c）-0016-05

[Abstract] Objective To observe the expression status of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） and glutathione （GSH） in retinal pigment epithelium （RPE） cells following the activation of protein kinase C （PKC） in rabbits. Methods Immunofluorescence staining was used to identify the original generation cultured RPE cells in rabbits. The third generation of RPE cells was divided into the control group （DMEM culture medium contains 15% fetal bovine serum， n=8）， the PMA group （DMEM culture medium contains 15% fetal bovine serum+4 μl 100 nmol/L PKC specific activator phorbol ester solution， n=8） and the PMA+BST group （pretreatment of RPE cells with 4 μl of 10 μmol/L Nrf2 inhibitor brusatol solution [BST] for an hour， aspirate and add DMEM culture medium containing PMA 4 μl of 100 nmol/L and 15% fetal bovine serum， n=8）， the incubation time of each group was 24 hours， Western-blot was used to detect the expression of Nrf2 protein in cytoplasm and nucleus. Then the GSH kit was used to detect the expression of GSH in RPE cells. And the correlation between the expression of Nrf2 in the nucleus and intracellular GSH was analyzed. Immunofluorescence staining was used to detect the translocation of Nrf2 protein in the cells. Results RPE cells showed melanin granules in the cytoplasm， long spindle-shape， and anti-human keratin （AE1/AE3） immunofluorescence staining showed strong positive. Western blot showed that the expression of Nrf2 protein in cell cytoplasm of the PMA group and the PMA+BST group were significantly down regulated compared with the control group， while the Nrf2 protein expression in cell nucleus was markedly up-regulated （all P<0.05）. Moreover，the difference in the expression of Nrf2 in cytoplasm and nucleus between the three groups was statistically significant （cytoplasm： F=26.62， P<0.05； nucleus： F=29.88， P<0.05）. GSH kit showed that， when compared with the control group， the intracellular expression levels of GSH in the PMA group and the PMA+BST group were significantly increased （all P<0.05）， and the GSH expression level of the PMA group was significantly higher than that of the PMA+BST group （P<0.05）. Nrf2 in the nucleus was positively correlated with GSM expression in the cell （R2=0.908， P<0.05）. Immunofluorescence staining showed that， compared with the control group， the Nrf2 protein expression in both the PMA group and the PMA+BST group was up regulated in the nucleus， and the nuclear translocation occurred， with more obvious nuclear translocation in the PMA group. Conclusion PKC activation can promote the antioxidant capacity of RPE cells， of which the mechanism of action is related to the regulation of PKC/Nrf2 signaling pathway.

[Key words] Retinal pigment epithelium； Protein kinase C； Nuclear factor erythroid 2-related factor 2； Glutathione

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是眼科常見的導(dǎo)致老年人視力受損的疾病之一，研究已證實(shí)氧化應(yīng)激對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelium，RPE）所造成的損傷是AMD一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制[1-3]。近年來發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是重要的氧化還原感受器，激活后可提高抗氧化基因的表達(dá)，從而達(dá)到抗氧化損傷的作用[4-6]。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是細(xì)胞內(nèi)重要抗氧化物質(zhì)，其表達(dá)水平揭示細(xì)胞的抗氧化能力[7-8]。在其他領(lǐng)域中有研究表明蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活能誘導(dǎo)Nrf2信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[9-10]，但關(guān)于PKC/Nrf2信號(hào)在AMD疾病中的表達(dá)及作用尚不明確。本研究擬通過體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞，并應(yīng)用PKC激動(dòng)劑PMA激活RPE細(xì)胞PKC表達(dá)，檢測(cè)RPE細(xì)胞Nrf2表達(dá)情況以及GSH表達(dá)水平，探討PKC活化對(duì)RPE細(xì)胞抗氧化的作用，并結(jié)合Nrf2抑制劑BST，闡明PKC/Nrf2信號(hào)對(duì)RPE細(xì)胞的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Nrf2抗、PKC抗體、AE1/AE3鼠抗人角蛋白抗體為美國Bioss公司產(chǎn)品，BST為加拿大TRC公司產(chǎn)品，細(xì)胞漿、核蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PMA為碧云天生物科技公司產(chǎn)品，胎牛血清為美國Hyclone公司；電泳儀、電泳槽為上海Tanon公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，倒置熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。青紫藍(lán)兔12只（24眼雌雄不限），體質(zhì)量（2.5±0.5）kg，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2方法

1.2.1兔RPE細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 手術(shù)摘除兔眼球，經(jīng)過無菌生理鹽水浸泡，PBS緩沖液沖洗后，去除眼球前節(jié)及玻璃體，制成眼杯，消化后收集細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)液接種、培養(yǎng)，傳代后，應(yīng)用AE1/AE3鼠抗人角蛋白抗體免疫熒光染色方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定，鑒定為RPE細(xì)胞后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥干預(yù) 取3代近乎融合的RPE細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共計(jì)分為空白對(duì)照組（15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，n=8）、PMA組[15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液+4 μl 100 nmol/L PKC特異激活劑佛波酯溶液（phorbol12-myristate13-acetate，PMA），n=8]、PMA+BST組[用4 μl 10 μmol/L Nrf2抑制劑鴉膽苦醇溶液（brusatol，BST）預(yù)處理RPE細(xì)胞1 h后，吸出并加入含PMA 4 μl 100 nmol/L的15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，n=8]，實(shí)驗(yàn)各組培養(yǎng)24 h。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 按細(xì)胞漿-細(xì)胞核蛋白提取試劑盒的方法提取各組樣品蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品濃度，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，12%分離膠），濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入Nrf2抗體（1∶1000），4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶4000）孵育2 h后再漂洗。ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，顯色后將膠片進(jìn)行掃描，采用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定檢測(cè)蛋白表達(dá)的灰度值，分別計(jì)算量化試驗(yàn)中蛋白表達(dá)的情況及樣品蛋白條帶/內(nèi)參對(duì)照條帶的灰度值。

1.2.4免疫熒光檢測(cè) 將第3代細(xì)胞接種到預(yù)先放置蓋玻片培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，Nrf2一抗稀釋液（1∶100），4℃孵育過夜，熒光二抗室溫下孵育1 h，用0.5 μg/ml DAPI避光孵育15 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.5 GSH試劑盒檢測(cè) 用GSH測(cè)定試劑盒提供相關(guān)試劑制備樣本溶液，置于96孔板，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm波長處的吸光度值（A值），將GSH溶液分別稀釋成50、25、15、10、5、2 mol/L，制作6個(gè)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本溶液的GSH濃度，對(duì)各組的RPE細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，采用回歸方程和R2進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1體外培養(yǎng)兔RPE細(xì)胞的鑒定

原代RPE細(xì)胞呈球形，細(xì)胞質(zhì)中可見黑色素顆粒（圖1A）。培養(yǎng)24～48 h細(xì)胞開始貼壁，集落樣生長呈不規(guī)則多角形，可見清晰透明的圓形細(xì)胞核及雙核細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)含豐富黑色素顆粒（圖1B）。7 d左右細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)，呈長梭形，排列致密（圖1C）。傳代24 h后貼壁，生長速度逐漸加快，每4～5天傳代。第3代RPE細(xì)胞經(jīng)鼠抗人角蛋白（AE1/AE3）免疫熒光染色鑒定呈強(qiáng)陽性（圖1D）。

2.2 Western blot檢測(cè)RPE細(xì)胞胞核和胞漿Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)

與對(duì)照組比較，PMA組和PMA+BST組胞質(zhì)內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)顯著減少，胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加，其中PMA組胞質(zhì)內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)較PMA+BST組顯著降低，而細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)則顯著增多（胞質(zhì)：F=26.62，P<0.05；胞核：F=29.88，P<0.05）（圖2、表1）。

2.3免疫熒光染色檢測(cè)Nrf2蛋白在RPE細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位情況

與對(duì)照組比較，PMA組和PMA+BST組RPE細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示Nrf2發(fā)生了核轉(zhuǎn)位，其中PMA組較PMA+BST組核轉(zhuǎn)位更為顯著（圖3）。

2.4 GSH在RPE細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

與對(duì)照組比較，PMA組細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)顯著增高[（90.569±8.101） vs. （47.452±3.172）mol/L，P<0.0001]；PMA+BST組細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)亦增高[（71.245±5.317） vs. （47.452±3.172）mol/L，P<0.05]；其中PMA組細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)顯著高于PMA+BST組（F=37.64，P<0.05）；PMA組隨機(jī)抽取四組樣本，線性回歸方程檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核Nrf2及細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)成顯著正相關(guān)（R2=0.908，P<0.05）（圖4）。

3討論

AMD是一種局限于黃斑區(qū)的視網(wǎng)膜慢性進(jìn)展性疾病，可引起患者視力喪失，并且隨著年齡的增長其發(fā)病率逐漸升高[11]。研究顯示，氧化應(yīng)激誘發(fā)RPE細(xì)胞損傷在AMD的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中極為重要[12-13]，所以，如何減少RPE細(xì)胞的氧化損傷將對(duì)治療AMD起到重要作用。PKC是一大類磷脂依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，在多種細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，通常是以無活性的形式存在于胞漿中，當(dāng)被激活時(shí)，PKC會(huì)從胞漿向胞膜上移位，經(jīng)過一系列復(fù)雜的磷酸化過程，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)作用[14-16]。高前應(yīng)等[17]的實(shí)驗(yàn)顯示，RPE細(xì)胞內(nèi)PKC轉(zhuǎn)位及其活化與RPE細(xì)胞的凋亡及分裂、增生有關(guān)。最近的研究顯示，Nrf2是細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，外源性或內(nèi)源性氧化應(yīng)激反應(yīng)大多是通過Nrf2/Keap1通路來進(jìn)行調(diào)節(jié)，在保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激和損傷中起到重要的作用[18-19]。Zhang等[20]的研究顯示，對(duì)鉛暴露所致的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷中，激活PKC蛋白激酶后，可對(duì)Nrf2蛋白磷酸化修飾，誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，啟動(dòng)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)抵抗氧化損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，PMA組和PMA+BST組細(xì)胞漿內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)顯著減少，而細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)顯著增多，其中PMA組胞漿內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)較PMA+BST組顯著降低，而細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)增多顯著，可以證實(shí)RPE細(xì)胞在給予PKC特異激活劑PMA使PKC特異激活后，經(jīng)過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，RPE細(xì)胞漿中的Nrf2發(fā)生了核轉(zhuǎn)位，使RPE細(xì)胞漿內(nèi)的Nrf2蛋白表達(dá)減少，而細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白表達(dá)增多。PMA+BST組胞漿和胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)變化的原因可能與Nrf2抑制劑BST預(yù)處理RPE細(xì)胞后，使Nrf2蛋白分子結(jié)構(gòu)中的絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生了改變，導(dǎo)致PMA對(duì)RPE細(xì)胞內(nèi)的Nrf2磷酸化水平降低有關(guān)。

綜上所述，本研究通過體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞，應(yīng)用PKC激動(dòng)劑和Nrf2阻斷劑進(jìn)行干預(yù)，對(duì)RPE細(xì)胞水平的相關(guān)信號(hào)通路、功能蛋白及抗氧化標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)和定位，證實(shí)PKC活化能夠促進(jìn)RPE細(xì)胞抗氧化能力，其作用機(jī)制可能與PKC/Nrf2信號(hào)通路調(diào)節(jié)有關(guān)，當(dāng)PKC信號(hào)系統(tǒng)被激活后主要通過磷酸化Nrf2分子上的絲氨酸/蘇氨酸，使其與胞漿蛋白伴侶分子Kea1發(fā)生解離，導(dǎo)致Nrf2向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，在核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件ARE相結(jié)合，促進(jìn)抗氧化基因GSH表達(dá)增強(qiáng)，從而增強(qiáng)RPE細(xì)胞的抗氧化損傷的能力。本項(xiàng)研究為AMD的發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供了一個(gè)新的理論依據(jù)，筆者將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過體內(nèi)動(dòng)物損傷模型進(jìn)一步證實(shí)此項(xiàng)理論的可行性，為AMD臨床治療提供新的治療思路。

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