呂嘉櫪，孟雁南，史朝燁，羅瀟

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）

茯磚茶屬于黑茶類，是一種后發(fā)酵茶，其特殊加工工藝在于“發(fā)花”過程，通過控制環(huán)境達到特定的溫濕度條件來促使自然益生菌體-“金花菌”的生長[1]，使得茶葉表面具有大量肉眼可見的金黃色顆粒，即“金花菌”的子囊果。因為“金花菌”的存在使得茯磚茶內(nèi)部成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，具有比其他黑茶更好的風(fēng)味及功能特性，因此“金花菌”的數(shù)量是判斷茯磚茶質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一[2～4]?！敖鸹ň笔巧⒛揖堪l(fā)菌科散囊菌屬的一種多型真菌，常見的是其有性繁殖方式，在某些條件下會出現(xiàn)無性繁殖特征[5]。目前對茯磚茶中“金花菌”的測定主要采用GB4789.15-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》中的方法[6]，并無專門的檢測方法。國標(biāo)法現(xiàn)已有許多爭議，首先國標(biāo)法檢測的不是真正意義上的“金花菌”，由于茶葉在處理過程中子囊破裂程度不一，其子囊果，子囊，子囊孢子均可以形成一個菌落，檢測差異較大，且無性繁殖特征的出現(xiàn)對檢測結(jié)果影響更大，此外國標(biāo)法測定的時間較長，不利于快速評價茯磚茶的質(zhì)量，因此急需一種適用于茯磚茶中“金花菌”數(shù)量的檢測方法。

如果可以找到一種能夠直接辨別茯磚茶中“金花菌”顆粒并計數(shù)的方法，且將其快速統(tǒng)計出來，則可以達到準(zhǔn)確檢測茯磚茶中“金花菌”數(shù)量并評價茯磚茶品質(zhì)的目的。本方法基于茯磚茶中“金花菌”顆粒較大，直徑在100 μm～175 μm之間[7,8]，顏色金黃色，與茯磚茶基質(zhì)及其他雜菌的顏色差異較大，且肉眼可以直接觀察的原理，結(jié)合Image Pro Plus軟件中的圖像處理功能和自動計數(shù)功能，設(shè)計出了一種準(zhǔn)確快速統(tǒng)計茯磚茶中“金花菌”數(shù)量的方法，為“金花菌”的數(shù)量檢測及茯磚茶的品質(zhì)評價提供理論技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 茯磚茶樣品

茯磚茶樣品主要采集自陜西省涇陽縣不同產(chǎn)區(qū)，參照 GB/T 8302[9]取樣方法采集成品包裝茯磚茶，采集的樣品均符合 GB/T 9833.3-2013[10]及 DBS 61/0006-2014[11]中對茯磚茶的感官要求，樣本信息如表1 所示。

表1 茯磚茶樣品Table 1 The sample of Fuzhuan brick tea

1.2 儀器與設(shè)備

高分辨率攝像機；Image Pro Plus圖像處理軟件。

1.3 實驗方法

1.3.1 茯磚茶切割及切割面成像

采用茶葉切割裝置按需要將茯磚茶進行任意面切割，之后采用高分辨率拍照設(shè)備對茶切割面進行拍照成像，獲取茶切割面圖像，并得到茶切割面的面積S。

1.3.2 圖像處理

采用Image Pro Plus對茯磚茶切割面進行圖像處理，總共分4個步驟。

（1）根據(jù)茯磚茶橫切面的大小對圖片進行 n等分，使得每個等分區(qū)域的“金花菌”顆粒數(shù)在 0～200個，對n個等分區(qū)域同時進行以下處理；

（2）處理Color Model，通過Color Channel，調(diào)節(jié)Color Model為HSI模式，設(shè)置Generate channel為Hue；

（3）進行Filter處理，首先進行Morphological/Filters/Open處理，使“金花菌”顆粒之間分離隔痕突出明顯，然后進行Edge/Filters/Variance處理，使“金花菌”顆粒邊緣突出明顯，最后進行 Enhancement/Filter/Sharpen處理，使“金花菌”顆粒邊緣銳化；

（4）進行 Contrast Enhancement處理，先進行Hilite & Shadow處理，增強“金花菌”顆粒Hilite度，降低茶磚背景的Shadow值，接著進行調(diào)節(jié)伽馬值，對比度和亮度，使圖片區(qū)分度更高。

1.3.3 “金花菌”數(shù)量檢測

采用Image Pro Plus軟件中Measure/Count/Size對處理后的圖像中“金花菌”進行自動計數(shù)。方法有兩種，方法一為Intensity Range Selection選擇Automatic Dark Objects的設(shè)置計出灰度在0～128的對象，點擊Count進行自動計數(shù)。點Delete可以恢復(fù)到計數(shù)前。方法二為Intensity range Selection選擇Manual，進行Select Colors，在Segmentation進行Color Cube Based選擇，用吸管工具選取圖片色彩“金花菌”的色彩范圍，相近色彩即自動被選中，然后點擊Count進行自動計數(shù)。在Segmentation進行Histogram Base選擇，將RGB改為HSI（H為色調(diào)，就是我們眼睛所看到的紅橙黃綠青藍紫等。S為色飽和度，I為強度），使用H，從H中選擇“金花菌”的色彩范圍，同理S，I，微調(diào)選擇線使選中區(qū)域?qū)⑺小敖鸹ň倍及ㄔ谄渲?。點擊Count進行自動計數(shù)；

當(dāng)圖片上有大量測量對象時，很難完全正確地選擇上所有測量區(qū)域，會有少量“金花菌”漏選或錯選，可將計數(shù)后的“金花菌”進行分析，自動確定“金花菌”顆粒的平均面積，確定范圍進行再次計數(shù)，記錄此次數(shù)值，將計入此次數(shù)量的非目標(biāo)物剔除，對圖片進行3次計數(shù)，直至把所有“金花菌”全部選中。最后統(tǒng)計結(jié)果，運用下列公式進行計算。

1.3.4 結(jié)果驗證

采用人工直接計數(shù)法對“金花菌”計數(shù)結(jié)果進行驗證。將拍攝得到的茯磚茶切面圖在進行圖像處理之前，肉眼直接統(tǒng)計圖片不同區(qū)域內(nèi)的“金花菌”顆粒數(shù)。驗證結(jié)果用相對誤差表示，相對誤差=|人工計數(shù)-自動計數(shù)|/自動計數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯磚茶切割及切割面成像

對茯磚茶進行任意面切割后采用高分辨率拍照設(shè)備對茶切割面進行拍照成像，獲取茶切割面圖像。切割效果如圖1所示。茶葉經(jīng)切割后，茶磚一分為二，切割面平整，茯磚茶內(nèi)部“金花菌”顆粒飽滿，顏色金黃，清晰可見，可直接用于后續(xù)的“金花菌”計數(shù)。

圖1 茯磚茶切割面Fig.1 Cutting surface of Fuzhuan brick tea

2.2 圖片預(yù)處理

將含有“金花菌”的茯磚茶表面成像到系統(tǒng)內(nèi)，將其平均等分為n個區(qū)域，如圖2所示，接下來對n個等分區(qū)域中的兩個區(qū)域（圖3）為案例，運用Image Pro Plus軟件系統(tǒng)進行以下分步處理展示，并準(zhǔn)確自動的記錄出茯磚茶表面“金花菌”數(shù)量。

圖2 茯磚茶n等分效果圖Fig.2 Dividing effect diagram of brick tea

圖3 茶磚切割面局部放大效果圖Fig.3 Partial enlargement of the cutting surface

2.3 顏色處理

由于攝像機電源本身的干擾噪聲、光照不均勻等問題都會影響到圖片采集的效果，使得“金花菌”顆粒不明顯（圖1），所以需要對圖片的顏色進行處理，可通過Color Channel，調(diào)節(jié)Color Model為HSI模式，設(shè)置Generate channel為Hue。處理結(jié)果如圖4所示，可看出經(jīng)過Color Model處理的“金花菌”，色澤與茶基質(zhì)差異更為明顯突出，但圖片中還有少量菌絲及其他非目標(biāo)雜質(zhì)，需要對其進行后續(xù)處理。

圖4 經(jīng)Color Model處理的“金花菌”Fig.4 “Golden Flower” fungus treated by color model

2.4 Filter處理

Filter工具可以提取圖形中的有用圖形信息，從而排除干擾測量的圖形信息。采用Filter主要對圖片進行了形態(tài)學(xué)、增強和邊緣三種處理。有一些“金花菌”顆粒由于各種原因連接在了一起，這樣在統(tǒng)計的時候軟件會把它們當(dāng)作一個完整顆粒，對結(jié)果造成誤差，所以，首先進行形態(tài)學(xué)處理，采用 Morphological/Filters/Open功能鍵，使“金花菌”顆粒之間分離隔痕突出明顯，處理效果如圖5所示，可以看出經(jīng)過形態(tài)學(xué)處理的“金花菌”邊緣變得平滑，原來圖片中白色的菌絲雜質(zhì)也被去掉，“金花菌”顆粒之間的連接被分開。但“金花菌”顆粒邊緣并不明顯，所以需要進行邊緣處理，即采用Edge/Filters/Variance功能鍵以強效“金花菌”邊緣，處理效果如圖6所示，可以發(fā)現(xiàn)“金花菌”顆粒邊緣突出明顯。但邊緣顏色過暗，與背景顏色區(qū)分度不高，所以需要對圖片進行增強處理，可采用Enhancement/Filter/Sharpen功能鍵，使“金花菌”顆粒邊緣銳化，處理效果如圖7所示，可以看出圖片中“金花菌”顆粒為黃色圓形，邊緣平整光滑，可與圖片背景及其他圖形雜質(zhì)區(qū)分。

圖5 經(jīng)形態(tài)學(xué)處理的“金花菌”Fig.5 “Golden Flower” fungus treated by morphological

圖6 經(jīng)邊緣處理的“金花菌”Fig.6 “Golden Flower” Fungus treated by Edge

圖7 經(jīng)增強處理的“金花菌”Fig.7 “Golden Flower” Fungus treated by Enhancement

2.5 Contrast Enhancement處理

經(jīng)濾鏡處理的“金花菌”雖與圖片背景區(qū)分，但圖片中“金花菌”亮度和對比度不一致，后期根據(jù)顏色計數(shù)時可能會存在誤差所以需要進行 Contrast Enhancement處理，先進行Hilite & Shadow處理，增強“金花菌”顆粒Hilite度，降低茶磚背景的Shadow值，接著進行調(diào)節(jié)伽馬值，對比度和亮度，處理效果如圖8所示，可以看出此處理可以突出測量對象，使金花菌與茶背景區(qū)分更加明顯，且“金花菌”具有獨特的形態(tài)學(xué)特征，可根據(jù)此種特征直接進行計數(shù)操作。

圖8 經(jīng)Contrast Enhancement處理的“金花菌”Fig.8 “Golden Flower” fungus treated by Contrast Enhancement

2.6 自動計數(shù)

采用吸管工具點擊目標(biāo)區(qū)域，就可選中該點的顏色，選取完AIO后就可以對選中的object進行自動計數(shù)操作。如圖9所示，圖中的綠色數(shù)字即為自動計數(shù)結(jié)果，區(qū)域1統(tǒng)計了73個“金花菌”顆粒，區(qū)域2統(tǒng)計了191個“金花菌”顆粒，可以看到還有少量未被系統(tǒng)識別的目標(biāo)，所以有必要在第一次測量后核對測量結(jié)果。

圖9 第一次自動計數(shù)結(jié)果Fig.9 First automatic counting result

對于未選中的區(qū)域，可以手工添加一個測量對象，在未選中的地方多次選取，直到把想選中的區(qū)域全部選中為止。將計數(shù)后的“金花菌”進行分析后，自動確定“金花菌”顆粒的平均面積，確定測量范圍進行再次計數(shù)，記錄此次數(shù)值，由圖10可看出，重復(fù)2次選擇目標(biāo)區(qū)域后，系統(tǒng)將圖9未統(tǒng)計出的“金花菌”顆粒進行了計數(shù)，圖10中數(shù)字前標(biāo)識P的即為新增加的“金花菌”顆粒數(shù)，由圖可看出區(qū)域1新增加了66個“金花菌”數(shù)量，區(qū)域2新增加了29個，每個區(qū)域的“金花菌”數(shù)量即為多次測量結(jié)果之和。

圖10 重復(fù)自動計數(shù)結(jié)果Fig.10 Repeated automatic counting results

最后將上述計數(shù)結(jié)果保存至測量環(huán)境文件夾中，此文件夾記錄了所有的參數(shù)設(shè)置，直接調(diào)用測量環(huán)境文件夾中的參數(shù)實現(xiàn)圖像批量化、快速處理，極大地提高了樣品的測量速度。保存步驟如下[12]：打開一張待分析的圖片，點擊菜單欄上的“Macro”-“Record Macro”按鈕，在彈出的“Record Macro”對話框中給文件夾輸入一個名字，如“金花菌數(shù)量測量”，在“Shortcut Key”中為該文件夾設(shè)置一個快捷鍵，如“Ctrl+A”（圖11）。將圖像處理、分析的過程錄制成一個宏文件后，直接使用“Ctrl+A”快捷鍵對茯磚茶的其他圖像進行“金花菌”計數(shù)。

圖11 通過錄制‘宏’文件實現(xiàn)圖像批處理Fig.11 Image batch processing by recording a “macro” file

2.7 結(jié)果統(tǒng)計與驗證

為了驗證此方法對圖片中“金花菌”計數(shù)的可行性，采用上述方法對其他區(qū)域中的“金花菌”子囊果進行計數(shù)，以人工直接計數(shù)法結(jié)果為對照，每個區(qū)域分別計數(shù)三次，計算兩種方法的相對誤差，統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。

表2 “金花菌”數(shù)量的計數(shù)結(jié)果Table 2 Counting results of the number of “Golden Flower” Fungus

從表2可以看出，自動計數(shù)結(jié)果與人工直接計數(shù)結(jié)果相比較，最大相對誤差為 2.59%，最小相對誤差為0.50%，平均相對誤差為1.43%，使用本方法對茯磚茶切面圖的每個區(qū)域檢測結(jié)果比人工直接計數(shù)法相對誤差較小，結(jié)果較為接近。且自動計數(shù)結(jié)果普遍略低于人工計數(shù)的結(jié)果，但標(biāo)準(zhǔn)偏差卻小于人工計數(shù)方法，這說明自動計數(shù)法在很大程度上避免了主觀誤差。

為了進一步驗證自動計數(shù)法在成品茯磚茶中計數(shù)的可行性，采用上述方法對每個茯磚茶切面中的金花菌進行計數(shù)，以人工直接計數(shù)法測得的金花菌數(shù)量為參考，每一樣品計數(shù)三次，利用EXCEL求得每一樣品在不同計數(shù)方法下的“金花菌”數(shù)量平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，利用SPSS軟件對不同樣品的兩種檢測結(jié)果進行配對t檢驗，結(jié)果如表3所示。

用SPSS對每個樣品在兩種檢測方法下的結(jié)果進行配對樣品t檢驗，由表3可以看出，圖像處理計數(shù)法對茯磚茶中“金花菌”的測定結(jié)果誤差較小，同一樣品三組平行測量值較為接近，且不同樣品采用圖像處理計數(shù)法和人工直接計數(shù)法測得的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差差別不大，t值在-4.274～0.113之間，基本為負(fù)值，說明圖像處理方法的檢測結(jié)果略低于人工測量結(jié)果，這可能是由于人工直接計數(shù)法是利用人工數(shù)茯磚茶表面的“金花菌”顆粒數(shù)，不可避免地對“金花菌”進行主觀選擇，所以計數(shù)結(jié)果略高。自由度為 2，顯著性 P值均大于0.05，說明圖像處理計數(shù)法與人工直接檢測結(jié)果之間的差異不顯著。以上分析說明圖像處理法的結(jié)果客觀性更強、準(zhǔn)確性較好，計數(shù)方法及結(jié)果可靠，可以用于茯磚茶中“金花菌”數(shù)量的檢測，且用軟件進行檢測能夠提高茯磚茶中“金花菌”數(shù)量檢測的速度及準(zhǔn)確性，從而達到快速準(zhǔn)確的評價茯磚茶質(zhì)量的目的，具有很高的實用性。

表3 茯磚茶“金花菌”計數(shù)比對表Table 3 The comparison table of the “Golden Flower” Fungus of Fuzhuan tea

3 結(jié)論

3.1 茯磚茶中“金花菌”的數(shù)量是判斷茯磚茶品質(zhì)的重要指標(biāo)之一?！敖鸹ň笔且环N既可產(chǎn)生子囊果也可產(chǎn)生分生孢子的多型真菌，子囊果圓形，內(nèi)部包裹著無數(shù)具擬薄壁組織的子囊，子囊內(nèi)含 8個子囊孢子[13,14]，其有性世代和無性世代在不同培養(yǎng)條件下表達數(shù)量不一[15～17]。而茯磚茶表面的金花即是“金花菌”有性世代的子囊果結(jié)構(gòu)[18]。對茯磚茶中“金花菌”的檢測方法都是按照GB 4789.15-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品微生物學(xué)檢驗中的霉菌和酵母計數(shù)的方法執(zhí)行的。但因該方法中樣品在前處理時“金花菌”破裂程度不一，其子囊果、子囊、子囊孢子均可形成單個菌落，使得“金花菌”的檢測重復(fù)率較低，計數(shù)結(jié)果也不是真正意義上的“金花菌”數(shù)量[19]，且茯磚茶中的有性子囊果在培養(yǎng)過程中會轉(zhuǎn)化為無性世代的分生孢子結(jié)構(gòu)[20]，呈煙灰色至灰綠色，與其他霉菌較難區(qū)別；其次由于茯磚茶發(fā)酵屬于較復(fù)雜的微生物發(fā)酵[21,22]，大量其他微生物的存在會抑制“金花菌”的生長，從而影響“金花菌”的檢測結(jié)果；第三，由于霉菌生長周期較長，該檢測方法需要一周左右，耗時長。第四，同一個樣品取樣點不一樣時，其檢測結(jié)果差異也較大。要解決國標(biāo)方法中存在的問題，可以采用加大樣品平行量的方法，但工作量較大，不現(xiàn)實；要么優(yōu)化“金花菌”數(shù)量的檢測方法，而目前對“金花菌”檢測方法優(yōu)化的研究少之又少，且均是基于國標(biāo)方法，雖使檢測誤差降低1個數(shù)量級，但耗時仍然很長[23,24]。

3.2 本方法基于茯磚茶中的“金花菌”顆粒在 100μm～175 μm之間，顏色為金黃色，與其它雜菌和茶基質(zhì)差異較大，在顯微鏡下清晰可辨的原理，利用人工直接計數(shù)的準(zhǔn)確性作為依據(jù)，通過茶的切割，獲得茶切割面，然后利用高分辨率拍照設(shè)備獲取茶切割面圖像，再利用本方法軟件自動計數(shù)方法進行茯磚茶中的“金花菌”的數(shù)量統(tǒng)計，結(jié)果表明：本檢測方法與人工直接計數(shù)法無差異，檢測結(jié)果可靠，快速準(zhǔn)確地實現(xiàn)了茯磚茶中“金花菌”數(shù)量的檢測；通過對茯磚茶切面圖像中“金花菌”的數(shù)量進行自動計數(shù)，能夠提高“金花菌”計數(shù)的準(zhǔn)確性，提高了計數(shù)的效率，從而實現(xiàn)準(zhǔn)確快速評價茯磚茶質(zhì)量的目的。本方法測得的結(jié)果是茯磚茶表面的“金花菌”形成的子囊果數(shù)量，與國標(biāo)等計數(shù)存在差異，雖然經(jīng)理論推理可行，采用茯磚茶樣品進行檢測后也與人工直接計數(shù)法無差別，但本方法還需對大量的茯磚茶樣品進行檢測，以完善其操作，并建立相關(guān)的檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)。