熊川，陳祖琴，吳正云，唐雪，朱宇

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所，四川成都 610061)

（2.四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610065）（3.四川師范大學生命科學學院，四川成都 610101）

曲，是一種利用微生物的發(fā)酵作用，將稻米、大小麥、豆類等分解成食品或食品原料的制品。制曲在中國有悠久的歷史，如紅曲等作為一種食藥兩用的傳統(tǒng)食品應用廣泛[1]，其抑菌、抗氧化的生物活性已被實驗證實[2]。在制曲過程中添加中藥而制成的曲稱為中藥曲，半夏曲和神曲是典型代表。某些中藥曲已被用于醫(yī)藥行業(yè)，具有健胃和食等臨床療效[3]。

制曲入藥能夠促進微生物生長繁殖、代謝過程與馴化。此外，能夠改善酒產(chǎn)品的風味。微生物代謝過程能夠產(chǎn)生大量的酶分解利用中藥材，并且中藥材經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用，其活性成分能獲得更充分的分離和提取，更易被機體吸收，從而更好地發(fā)揮天然中草藥的藥效。根據(jù)制曲工藝的不同，添加中藥材的種類、添加方式及添加量各有區(qū)別。研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥材對有害菌具有較強的抑制作用，而對功能菌無害，并且還可促進其生成與酶代謝。如薄荷、杏仁、桑葉等對酵母有益，而木香對根霉有害[4]。因此，在傳統(tǒng)制曲工藝中加入中藥材，能夠提高制曲效率，并且豐富中藥曲活性，具有更大的應用價值。

本實驗所用中藥米曲系采用日本純種米曲的制曲工藝，添加多種傳統(tǒng)中藥材制作的純中藥米曲。前期實驗證實，西洋參、黃芪和紅景天最適宜用以制作藥曲，西洋參制曲的最佳添加量為0.20%～0.4%，黃芪和紅景天制曲的最佳添加量為0.1%～0.4%，較傳統(tǒng)中藥曲，本實驗所用中藥米曲具有更好的糖化力和液化力[5]。目前，在對中藥曲的研究中，大部分都是對其工藝、菌株等的研究，而對其活性成分、功能等研究較少。本研究主要探索中藥米曲中總多酚、總黃酮及多糖（The polysaccharides of Chinese herbs-koji，HKP）含量并評價多酚、黃酮的抗氧化及多糖的免疫調(diào)節(jié)活性，為中藥曲的深入開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中藥米曲，由四川大學輕紡與食品學院提供；RAW 264.7（小鼠腹腔單核巨噬細胞系，ATCC Number：TIP71）細胞，美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）菌種保藏中心；胎牛血清、細胞培養(yǎng)液（dulbecco's modified eagle medium，DMEM），Thermo Scientific公司；青霉素、鏈霉素，美國Sigma公司；一氧化氮檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；小鼠白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，白細胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)，腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)細胞因子檢測試劑盒，美國BD公司。焦性沒食子酸、蘆丁，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

MCO-15AC CO2細胞培養(yǎng)箱(日本 SANYO 公司)；Spectra max plus 384酶標儀(美國 Molecular Devices公司)；LSC plus真空冷凍干燥機(德國Christ公司)；IX73倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 多酚提取測定

根據(jù)蔡建秀等[6]的方法完成中藥曲多酚的提取與含量測定。稱取中藥曲20 g，加入1000 mL 40%的乙醇浸泡，超聲提取條件為80 kHz，在35 ℃條件下處理15 min。過濾收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，獲得中藥曲多酚浸膏。以焦性沒食子酸繪制標準曲線并得到線性回歸方程，測定中藥曲多酚的含量。

1.3.2 黃酮提取測定

根據(jù)鄭亞美等的方法完成中藥曲黃酮的提取與含量測定[7]。稱取中藥曲20 g，加入600 mL 80%的乙醇，在80 ℃條件下浸提6 h。過濾收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，獲得中藥曲黃酮浸膏。以蘆丁標準品繪制標準曲線并得到線性回歸方程，測定中藥曲黃酮的含量。

1.3.3 多糖(HKP)提取測定

采用水提醇沉法獲得中藥曲多糖[8]。準確稱取20 g中藥曲置于1000 mL錐形瓶中，加入800 mL純水進行超聲波提取，提取完畢后冷卻至室溫，補液至提取前的量，5000 r/min離心10 min，取上清，減壓蒸餾濃縮，濃縮產(chǎn)物加入9倍體積無水乙醇，醇沉過夜，醇沉產(chǎn)物通過6000 r/min離心收集沉淀，苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.3.4 自由基清除活性測定

依據(jù)Oktay等的方法完成DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力測定[9]。樣品(1 mg)溶解于10 mL的純水中，稀釋成濃度為0～50 μg/mL待用。陽性對照設定為VC，同一測定重復3次。

1.3.5 中藥曲多糖(HKP)對脾細胞的增殖作用

取3～5 mL無菌Hank’s液于無菌平皿中，無菌取脾置于平皿，用注射器內(nèi)芯輕輕磨碎脾臟，制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank’s液洗2次，每次1000 r/min離心10 min。然后將細胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中，顯微鏡計數(shù)脾細胞，調(diào)整至細胞濃度為3×106個/mL。

HKP對靜息期脾細胞的增殖的影響。將細胞懸液加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，加入培養(yǎng)液配置的不同濃度HKP (0.05、0.10、0.50、1.00 mg/mL) 100 μL，陰性對照設定為無 HKP的培養(yǎng)液，未加細胞的孔作為空白對照。置于CO2為5%，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL無血清DMEM培養(yǎng)液，同時每孔加入50 μL MTT (5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，超聲振蕩(2 s)混勻，至紫色結(jié)晶完全溶解。吸液至96孔培養(yǎng)板，每個孔分裝3孔作為平行樣，570 nm波長測定OD值。

HKP對刀豆蛋白A (concanavalin A, ConA)誘導的小鼠T淋巴細胞增殖的影響。將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，每孔加75 μL ConA液(相當于7.5 μg/mL)，其余操作同上。

HKP對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的小鼠B淋巴細胞增殖的影響。將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，每孔加40 μL LPS (相當于4 μg/mL)，其余操作同上。

1.3.6 HKP的免疫調(diào)節(jié)作用

采用RAW 264.7細胞株吞噬中性紅評價中藥曲多糖的促巨噬細胞吞噬能力。RAW 264.7細胞以濃度2×104個/mL鋪96孔板，每孔 100 μL。對照組(CK)設定為：100 μL細胞懸液+100 μL DMEM細胞培養(yǎng)液；實驗組：100 μL細胞懸液+80 μL DMEM細胞培養(yǎng)液+20 mL HKP，最終保證中藥曲多糖終濃度分別為25、50、100和 200 μg/mL，陽性對照設定終濃度為 10 μg/mL的LPS，每組均設立8個重復。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用PBS洗滌3次，之后加入中性紅溶液 100 μL使其終濃度為 1 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng) 30 min。吸棄中性紅溶液，洗滌3次，加入裂解液(冰醋酸:無水乙醇=1:1，體積比) 200 μL，靜置過夜，待完全裂解細胞后，540 nm波長下測定吸光度值。

采用Griess試劑法測定中藥曲多糖對RAW 264.7細胞分泌NO的影響。RAW 264.7細胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋成1×105個/mL，加入到24孔板中。然后終濃度為25、50、100、200 μg/mL的中藥曲多糖，陽性對照LPS終濃度為10 μg/mL。培養(yǎng)72 h，每隔24 h測定一次NO含量。采用Griess試劑法的NO試劑盒測定，操作步驟按說明書進行，以標準品濃度為橫坐標，對應OD值為縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，擬合得出回歸方程，按曲線方程計算各樣品中的濃度值。

RAW 264.7細胞(1×105個/mL)接種到 24孔板(1 mL/孔)中進行培養(yǎng)，實驗設置同上。培養(yǎng)結(jié)束后，取上清液，使用小鼠白細胞介素-1β(IL-1β)，白細胞介素-6 (IL-6)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA 試劑盒測定其中的IL-1β、IL-6和TNF-α細胞因子濃度，操作步驟參照試劑盒操作說明書。用酶標儀或紫外分光光度計在450 nm波長下測定吸光度(OD值)。以標準品濃度為橫坐標，對應OD值為縱坐標，繪制出標準品擬合線性回歸曲線，得出回歸方程，按曲線方程計算各樣品中的濃度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計

2 結(jié)果與討論

2.1 中藥曲活性成分含量

以焦性沒食子酸繪制標準曲線并得到線性回歸方程為 Y=0.1191X+0.0169，R2=0.9912，得出中藥曲中總多酚的含量為33.54 mg/g。以蘆丁標準品繪制標準曲線并得到線性回歸方程為 Y=0.9929X+0.0367，R2=0.9998，得出中藥曲中總黃酮含量為10.88 mg/g。水提醇沉法獲得中藥曲多糖，含量為74.98 mg/g。

2.2 中藥曲的自由基清除活性

圖1 中藥曲多酚和黃酮清除DPPH自由基(a)、羥自由基(b)及超氧陰離子自由基(c)的活性Fig.1 Scavenging activity of polyphenols and flavonoids on DPPH radical (a), hydroxyl radical (b) and superoxide radical(c)

中藥曲多酚和黃酮的DPPH自由基清除能力測定結(jié)果如圖 1a所示，中藥曲多酚和黃酮具有較顯著的DPPH自由基清除能力，且具有劑量依賴關系，高濃度的多酚及黃酮的清除活性接近同濃度的Vc，多酚的IC50值為 18.87 μg/mL，黃酮的 IC50值約為 33.24 μg/mL。圖1b中，多酚及黃酮具有較好的羥自由基清除能力。多酚的IC50值為26.24 μg/mL，黃酮的IC50值為38.97 μg/mL。圖1c中，高濃度的多酚及黃酮(50 μg/mL)對超氧陰離子自由基清除活性接近60%，多酚的IC50值為33.31 μg/mL，黃酮的IC50值約為33.08 μg/mL。

人類上百種疾病的發(fā)生都可以追溯到活性氧自由基上，大量的活性氧自由基會攻擊包括蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)在內(nèi)的幾乎所有生物大分子，對生物體產(chǎn)生嚴重的氧化損傷[11]。已有研究表明，DNA突變，衰老，動脈粥樣硬化，炎癥，神經(jīng)退行性疾病及腫瘤病變等都涉及氧化壓力[12]。本實驗首先測定了中藥米曲的自由基清除活性。中藥米曲對DPPH自由基清除活性很高，對于羥自由基及超氧陰離子自由基也具有一定的清除作用。由此可知，中藥米曲中含有的總多酚和總黃酮是一種具有還原性的天然活性物質(zhì)。已有學者報道了天然物質(zhì)中多酚和黃酮的自由基清除活性。山豆根黃酮對DPPH自由基，羥自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用，半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為9.52、14.44、17.21 μg/mL[13]，蜜柚葉黃酮的IC50值分別為：1.47、1.04、1.49 mg/mL[7]。本實驗獲得的中藥米曲總黃酮則為33.24、38.97、33.08 μg/mL。由此可知，原材料、提取方法等對獲得的黃酮類化合物自由基清除活性影響很大，在獲得的總黃酮基礎上，更精細的分離鑒定是今后研究的重點。

2.3 HKP的促脾細胞增殖作用

HKP對靜息期脾細胞的增殖具有明顯的促進作用。當HKP的作用濃度達到0.5 mg/mL時，脾細胞數(shù)目為0.282，與對照組(0.218)呈現(xiàn)顯著性差異。

在實驗設定的范圍內(nèi)，HKP對脾細胞的增殖作用呈現(xiàn)劑量依賴關系。HKP對ConA活化的T淋巴細胞的促增殖作用較弱，呈現(xiàn)出低濃度無效，中濃度微弱刺激，高濃度抑制增殖的關系。而HKP對于LPS活化的B淋巴細胞的促增殖作用較強，僅0.05 mg/mL的 HKP就能夠帶來極顯著的促進作用，但是高濃度的HKP(1 mg/mL)對于活化的B淋巴細胞的增殖具有抑制作用。

表1 中藥曲多糖對免疫細胞增殖的影響Table 1 Effect of HKP on the proliferation of immune cells

脾臟是人體最大的外周免疫器官，為免疫活性細胞定居的部位，是進行免疫應答及產(chǎn)生免疫效應物質(zhì)的重要基地。HKP能有效促進脾淋巴細胞的增殖，并與ConA，LPS對T、B淋巴細胞的增殖有協(xié)同刺激作用。Con A是T淋巴細胞的有絲分裂原，可促進T淋巴細胞活化，進而使細胞因子合成、細胞因子受體表達、細胞分化及細胞增殖等變化。適宜濃度的 HKP能有效促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖，對生物體自身免疫可能具有一定的強化作用。

2.4 HKP的免疫調(diào)節(jié)活性

采用中性紅實驗對HKP促進RAW 264.7細胞的吞噬能力進行評價，結(jié)果如圖2所示，HKP對RAW 264.7細胞的吞噬中性紅的能力有明顯的促進作用。給以最低劑量的HKP (25 μg/mL)處理后，RAW 264.7細胞的吞噬作用較空白對照提升了近1倍。50 μg/mL的HKP的促進作用與陽性對照(LPS，10 μg/mL)接近。100 μg/mL的HKP促吞噬作用相比較陰性對照，呈現(xiàn)出了極顯著差異p＜0.01，強于陽性對照組LPS。

圖2 HKP促進RAW 264.7細胞吞噬中性紅Fig.2 Enhanced phagocytosis of RAW 264.7 cells by HKP

根據(jù)Griess試劑法繪制NO測定標準曲線，建立回歸方程如下：Y=0.0322X+0.0968，R2=0.9962(X為所測標準品濃度，Y為所測吸光值)，該回歸方程適用的吸光度范圍：0～3.3。

根據(jù)標準曲線的回歸方程，計算得出各劑量組作用下RAW 264.7細胞培養(yǎng)上清液中的NO濃度，其結(jié)果如圖3所示，研究發(fā)現(xiàn)HKP對RAW 264.7細胞在培養(yǎng)過程中，能非常顯著的刺激RAW 264.7細胞分泌NO，并在最低劑量組25 μg/mL就與陰性對照組呈現(xiàn)出極顯著差異p＜0.01，且高劑量組(100 μg/mL和200 μg/mL)與陽性對照組LPS效果相當。此外，HKP與RAW 264.7細胞共同培養(yǎng)40 h，NO的含量顯著升高并在高位持續(xù)8 h，超過48 h下降。

圖3 HKP促進RAW 264.7細胞產(chǎn)生NO作用(a)和RAW 264.7細胞產(chǎn)生NO時間點(b)Fig.3 HKP stimulated RAW 264.7 cells NO production (a) and its point in time (b)

HKP能顯著提高RAW 264.7細胞中TNF-α的含量水平，在實驗范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴關系。HKP濃度為25 μg/mL時，細胞中TNF-α的含量達到58.4 pg/mL，與空白對照組相比，呈現(xiàn)極顯著差異，高濃度的HKP(100 μg/mL和200 μg/mL)促進作用強于陽性對照(10 μg/mL的LPS)。HKP也能不同程度地提高RAW 264.7細胞IL-1β和IL-6含量水平，且對IL-6的促進作用更明顯。

巨噬細胞存在于機體的幾乎所有組織中，在先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮中心作用，是機體免疫防御陣線的關鍵成員[14]。吞噬能力是巨噬細胞的主要生理功能，巨噬細胞能夠有效吞噬外來的病原體、細胞殘片和其他小分子。此外，巨噬細胞能夠遞呈抗原、分泌生物活性物質(zhì)，如細胞因子等，從而調(diào)控局部微環(huán)境，抵御外界不良因素的侵害。實驗表明，HKP能夠有效促進RAW 264.7細胞的吞噬能力，表明中藥曲多糖具有提高先天免疫反應的能力。

圖4 HKP促進促RAW 264.7細胞產(chǎn)生細胞因子作用Fig.4 The effects of HKP stimulated cytokines secretion in RAW 264.7 cells

NO被認為是一種重要的活性介質(zhì)，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的NO分子在宿主免疫防御、組織修復等生理活動中發(fā)揮重要的作用[15]。巨噬細胞合成釋放的NO具有細胞毒作用，不僅可殺傷侵入機體的微生物，而且還能夠阻止癌細胞的繁殖，阻止腫瘤細胞擴散。此外，NO可以作為一種內(nèi)皮細胞松弛因子，可以松弛血管平滑肌，抑制血小板凝聚，在神經(jīng)傳導、學習記憶方面發(fā)揮作用。因此，研究認為，巨噬細胞的抗腫瘤、抗病毒、炎癥反應及免疫反應由NO的釋放來完成。用Griess法測定NO生成量，結(jié)果表明HKP能顯著提高巨噬細胞的NO釋放，且共培養(yǎng)48 h刺激作用達到峰值，NO含量會在高位維持約8 h。后續(xù)研究可以關注HKP促進NO釋放的作用機制，完善HKP開發(fā)利用所需的基礎數(shù)據(jù)。

中藥曲多糖能夠促進RAW 264.7細胞分泌細胞因子。細胞因子是由多種細胞產(chǎn)生的多肽分子，通過調(diào)節(jié)細胞分化、生長和凋亡控制整個機體的動態(tài)平衡，對天然免疫和適應性免疫均有調(diào)控作用[16,17]。

活化的巨噬細胞可以分泌IL-6、IL-1β、α干擾素(IFN-α)和γ干擾素(IFN-γ)等細胞因子，以此來進行免疫調(diào)節(jié)[18]。實驗表明，HKP能顯著促進 RAW 264.7細胞的細胞因子的分泌，能有效激活巨噬細胞，對其具有免疫調(diào)節(jié)活性。相關研究證實，激活巨噬細胞是先天和適應性免疫防御病原體的一個關鍵事件，因此，可圍繞介導巨噬細胞激活的一系列信號轉(zhuǎn)導途徑進行后續(xù)相關研究，以探索更精細的作用通路。

3 結(jié)論

3.1 本文對一種中藥米曲的活性成分進行了提取分離，獲得了黃酮、多酚及多糖等3種功效成分，分別測定了黃酮、多酚的抗氧化作用及多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。中藥曲黃酮和多酚具有較強的自由基清除活性，中藥曲多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，能直接促進脾細胞及免疫細胞的增殖，對于RAW 264.7細胞的吞噬能力及細胞因子分泌具有促進作用。

3.2 綜上，本實驗所得結(jié)果為中藥米曲相關抗氧化、免疫強化產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的理論指導及借鑒作用，同時中藥曲中的活性物質(zhì)為進一步開發(fā)研究功能性中藥產(chǎn)品奠定了基礎。