黃玉龍，高清雅，全婷，孫若詩，張芳，李偉綺，張繼,

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州 730070）（2.甘肅省特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730070）（3.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

蘭州百合(Lilium davidiivar.unicolorSalisb.)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本球根植物，也是唯一的藥食兩用的甜百合，從種子到商品蘭州百合在土壤中生長6～9年[1]。蘭州百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，可入藥對陰虛久咳、失眠煩躁等癥有寧心安神、滋陰潤燥、健胃消積等功效[2]。蘭州百合鱗莖營養(yǎng)豐富，含糖量高，鮮百合總糖含量13.39%，還含有皂苷、類黃酮、生物堿、多種維生素、總類胡蘿卜素、8種人體必需氨基酸和12種人體必需微量元素等成分。蘭州百合多糖(LPS)是蘭州百合的主要功能成分之一，不同產(chǎn)地的蘭州百合其多糖含量可達干重的21.9%～31.2%。蘭州百合多糖具有提高免疫力、耐疲勞、降血糖、潤肺止咳等功效。劉成梅等研究發(fā)現(xiàn)，LPS有降血糖功能，可調(diào)節(jié)小鼠β-胰島細(xì)胞功能紊亂，促進胰島素分泌[2]。楊穎等對LPS的抑瘤作用研究發(fā)現(xiàn)，LPS可通過提高機體免疫功能增強化療藥物的抑瘤效果，并降低化療的毒性損傷[3]。苗明三等發(fā)現(xiàn)LPS具有免疫調(diào)節(jié)作用，可提高免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率，促進淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化[4]。滕利榮等利用酶解提取LPS的研究發(fā)現(xiàn)，酶促反應(yīng)時間、溫度、pH和加酶量等參數(shù)的選擇會影響LPS的提取[5]。LPS的相關(guān)研究主要集中在降血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及提取工藝等方面。多糖的活性功能與其自由基清除能力密切相關(guān)，而不同的提取方法會顯著影響多糖的提取率、結(jié)構(gòu)特征以及自由基清除能力等生物活性[6]。目前，不同提取方法與蘭州百合多糖的結(jié)構(gòu)組成及抗氧化活性之間的關(guān)系未見報道。因此，本試驗比較了微波輔助、超聲輔助及超聲復(fù)合酶提取法對所得蘭州百合多糖的結(jié)構(gòu)組成的影響，并對所提取多糖的體外抗氧化活性進行了研究，從而確定制備較高抗氧化活性蘭州百合多糖的方法，以期為功能性百合多糖的綜合開發(fā)利用提供一定的技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

蘭州百合，產(chǎn)自蘭州市七里河區(qū)西果園鎮(zhèn)。百合鱗莖剝片清洗后于60 ℃下熱風(fēng)烘干，粉碎后過60目篩備用。

硫酸亞鐵、三氟乙酸（TFA）、乙醇、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、還原型輔酶I(NADH)、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、氯化氮藍(lán)四唑(NBT)、過氧化氫（H2O2）、氯化亞鐵(FeCl2)、三氯化鐵（FeCl3）及鐵氰化鉀均為國產(chǎn)分析純；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美國Sigma公司；凝乳酶(20000 U/g)、纖維素酶(40000 U/g)，天津利華酶制劑技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV1000紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；DF-101B集熱式恒溫磁力攪拌器(金壇友聯(lián)儀器研究所)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海市亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋（上海智城分析儀器公司）；LGJ-18S冷凍干燥機（河南兄弟儀器公司）；BL320H電子天平（賽多利斯公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（西安太康生物科技公司）；TDL5M臺式大容量冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 LPS的提取

依據(jù)前期試驗[7]，以蘭州百合鱗莖粉為原料，采用微波輔助、超聲波輔助和超聲復(fù)合酶法對其多糖進行提取，蒸餾水作為浸提液，利用不同提取條件提取蘭州百合多糖（詳見圖1）。提取液離心后，上清液減壓濃縮至原體積的1/3，再加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃下靜置12 h，離心后收集沉淀，用Sevag法脫蛋白后醇沉過夜并離心，用無水乙醇將沉淀洗滌3次，真空冷凍干燥之后，得到3種蘭州百合多糖粉樣品備用。

圖1 蘭州百合多糖的提取工藝流程Fig.1 The extraction processes of LPS

1.3.2 紅外光譜表征（FT-IR）

采用Thermo Nicolet iS10紅外光譜儀對多糖的分子結(jié)構(gòu)進行分析。取充分干燥的百合多糖樣品 2 mg于瑪瑙碾缽中，與KBr壓片，在400～4000 cm-1范圍內(nèi)掃描，掃描次數(shù)16次，分辨率4 cm-1。

1.3.3 GC-MS單糖組成分析

稱取LPS 10 mg加入4 mol/L TFA溶液4 mL，在氮氣保護下120 ℃水解10 h，減壓蒸餾除去TFA。在90 ℃下加入鹽酸羥胺10 mg和吡啶0.5 mL反應(yīng)30 min，冷卻后加入乙酸酐0.5 mL，90 ℃下乙?；磻?yīng)30 min，減壓蒸干。經(jīng)氯仿萃取，0.22 μm微孔濾膜過濾，GC-MS（Thermo Focus GC-Polaris Q MS）進樣0.2 μL分析。GC柱TR-5 ms SQC column，30×0.25 μm，120 ℃保持3 min后，以5 ℃/min升溫至250 ℃并保持5 min。載氣為高純氦氣，1.0 mL/min柱流量，分流比1:50，進樣口的溫度為250 ℃[8]。

標(biāo)準(zhǔn)單糖為鼠李糖、木糖、來蘇糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，標(biāo)品處理方法同上。

1.3.4 對DPPH自由基的清除作用[9,10]

精確稱取LPS樣品和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT），分別配制濃度為0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1、2 mg/mL的LPS樣品溶液和BHT溶液。準(zhǔn)確量取2 mL LPS或BHT溶液，加入0.5 mL現(xiàn)配的0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液混合搖勻，置于暗箱30 min后以對應(yīng)的溶劑調(diào)零，在517 nm處測定吸光值A(chǔ)i。同時測定2 mL多糖樣品或BHT溶液與0.5 mL對應(yīng)溶劑混合均勻的517 nm處吸光值A(chǔ)j。再測定0.5 mL的0.2 mmol/L的DPPH溶液與0.5 mL對應(yīng)溶劑混合均勻的517 nm處吸光值A(chǔ)0。重復(fù)3次求平均值。計算公式為：

1.3.5 對羥自由基（·OH）的清除作用[9,10]

精確稱取抗壞血酸（Vc）與LPS樣品，配制7個不同濃度0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1、2 mg/mL 的樣品溶液待用。分別量取2 mL的各濃度多糖和Vc溶液，依次加入2 mL的 6 mmol/L的FeSO4、6 mmol/L H2O2溶液，混勻后靜置10 min，再加入2 mL的 6 mmol/L 水楊酸混勻靜置30 min于510 nm下測定吸光值A(chǔ)i，用蒸餾水代替水楊酸測定Aj，空白對照用雙蒸水代替樣品測定A0，重復(fù)3次，求平均值。計算·OH清除率公式為：

1.3.6 對超氧陰離子（·O2-）的清除作用[9,10]

精確稱取Vc與LPS樣品，配制成7個濃度分別為0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1、2 mg/mL的溶液。采用PMS-NADH-NBT體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基。分別量取1 mL各濃度多糖和Vc溶液，依次加入濃度為557 μmol/L的NADH-Na2、45 μmol/L的PMS、108 μmol/L的NBT各1 mL，混勻后于25 ℃下溫浴5 min，以蒸餾水調(diào)零，在510 nm處測吸光值A(chǔ)i，蒸餾水代替多糖溶液，測定A0，重復(fù)3次，取平均值。計算超氧陰離子（·O2-）清除率公式為：

1.3.7 還原力

精確稱取 Vc與LPS樣品，配制成7個濃度為0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1、2 mg/mL的樣品溶液。分別量取1 mL各濃度多糖和Vc溶液，依次加入2.5 mL磷酸緩沖液（pH 6.6）、2.5 mL鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）溶液（1 wt%），混勻后50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10 wt%），混勻1000 r/min離心10 min，上清液取2.5 mL，再加入2.5 mL蒸餾水和2.5 mL氯化鐵（FeCl3，0.1 wt%），混勻靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，在700 nm處測定吸光值，重復(fù)3次，求平均數(shù)表示還原力大小。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)取 3次平行重復(fù)的平均值，應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間比較采用雙尾t-檢驗，試驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±sd）表示，以p＜0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 LPS的紅外光譜

圖2 蘭州百合多糖的紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectroscopy of LPS

通過紅外光譜可以鑒定是否具有多糖的結(jié)構(gòu)特征，圖2為不同方法提取的蘭州百合多糖的紅外光譜圖。從圖2可以看出，三種方法得到的蘭州百合多糖在3378 cm-1附近有較強且寬的吸收峰，為O-H伸縮振動，說明該多糖的分子間和分子內(nèi)都存在氫鍵；2931 cm-1附近是由C-H伸縮振動引起的吸收峰；1647 cm-1附近的吸收峰是由COO-基團的C=O非對稱伸縮振動引起的，該多糖可能是羧酸或羧酸鹽；在 1066 cm-1出現(xiàn)的強吸收峰是由糖環(huán)中C-O-C的非對稱伸縮振動引起的，表明百合多糖具有吡喃環(huán)的構(gòu)象。

2.2 LPS的單糖組成

圖3 單糖水解衍生物的GC-MS圖Fig.3 The GC-MS chromatogram of monosaccharides hydrolyzed derivatives

圖3（a、b、c、d）為單糖標(biāo)品和LPS的水解衍生物的GC-MS色譜圖。由圖可知，不同提取方式得到的LPS，其單糖組成均為甘露糖與葡萄糖，但其摩爾比卻發(fā)生了變化，LPS-M、LPS-C、LPS-CE中甘露糖與葡萄糖的摩爾比為分別為5.2:4.9、5.1:4.7、4.8:5.3。這可能與微波輻射導(dǎo)致多糖分子的交聯(lián)，以及超聲振動導(dǎo)致糖鏈分子斷裂有關(guān)。

2.3 LPS的體外抗氧化活性

2.3.1 對羥自由基（·OH）的清除作用

圖4 提取方法對LPS清除·OH能力的影響Fig.4 Effect of extraction methods on LPS scavenging activity of ·OH radicals

羥自由基是一個氧化能力很強的自由基，可使糖類、核酸、氨基酸和脂類等發(fā)生氧化，從而對機體造成不同程度的損壞[11]?？箟难崾浅Ｓ每寡趸瘎?，通過把電子和質(zhì)子傳遞給自由基，從而達到清除自由基的抗氧化作用。由圖4可知，微波、超聲、超聲復(fù)合酶 3種提取方法對蘭州百合多糖 LPS清除羥自由基（·OH）的影響隨濃度的增大而增強，呈劑量依賴關(guān)系。LPS-CE、LPS-C、LPS-M濃度從0.02 mg/mL增長到2 mg/mL時，清除率分別為85.80%、79.81%、46.03%，而Vc濃度變化時清除率從23.60%到95.07%，清除能力迅速增長。微波輔助提取的LPS對羥自由基的清除能力多糖顯著低于超聲復(fù)合酶與超聲輔助提取（p＜0.05）。這可能與微波處理改變了多糖構(gòu)象影響了對羥自由基（·OH）的清除能力有關(guān)。

在自氧化體系中釋放的高毒性超氧陰離子自由基可經(jīng)過反應(yīng)生成其它氧自由基，損傷重要的生物大分子，從而導(dǎo)致許多疾病。因此及早清除肌體內(nèi)聚集的超氧陰離子意義重大[12,13]。圖5所示，在本試驗濃度范圍內(nèi)，3種提取方式得到的多糖對均有一定的清除作用，并隨著濃度增加清除作用增強。在濃度為0.1 mg/mL時，LPS-CE、LPS-C、LPS-M對的清除作用相近，但都低于Vc。濃度超過1 mg/mL后，LPS-CE、LPS-C、LPS-M清除超氧自由基的作用達到平衡，最大清除率分別為 70.80%、56.22%、43.01%。隨著濃度增加，Vc對清除力上升較快，質(zhì)量濃度超過0.2 mg/mL時，Vc對的清除作用趨于平緩，清除率達到81.58%，在相同濃度下，LPS-CE的抗氧化活性優(yōu)于LPS-C、LPS-M，其原因可能有：超聲復(fù)合酶法大大縮短了提取時間，在短時間內(nèi)多糖生物活性沒有損失；不同提取方式造成多糖分子的單糖組成及糖苷鍵型不同從而使多糖的抗氧化活性存在差異[14]。

圖5 提取方法對LPS清除能力的影響Fig.5 The effect of extraction methods on LPS scavenging activity of radicals

2.3.3 對DPPH自由基的清除作用

DPPH是以氮為中心的穩(wěn)定自由基，呈典型的紫色，其517 nm處的特征吸收峰會隨著被還原而逐漸消失[15]。

圖6 提取方法對LPS清除·DPPH能力的影響Fig.6 The effect of extraction methods on LPS scavenging activity of ·DPPH radicals

由圖 6可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，3種 LPS對DPPH自由基的清除率都隨各自濃度的升高而增大，并呈劑量依賴，而其相互大小順序為LPS-CE＞LPS-M＞LPS-C。當(dāng)LPS的濃度高于1 mg/mL時，這種趨勢趨于平緩。LPS-M、LPS-C和 LPS-CE對 DPPH自由基的清除率分別為67.77%、61.70%和57.06%。LPS-CE與 LPS-M、LPS-C之間差異顯著（p＜0.05）。LPS濃度達到2 mg/mL時對DPPH自由基的清除率沒有顯著增強，這主要是由于多糖的溶解度的限制以及氫鍵的增加所造成的。

2.3.4 還原力

抗氧化劑的抗氧化活性與其還原力有直接的聯(lián)系，通過測定體系中Fe3+-Fe2+的轉(zhuǎn)化，多糖的還原能力越強，抗氧化性就越強[16]。

圖7 提取方法對LPS還原能力的影響Fig.7 The effect of extraction methods on reducing activity of LPS

由圖7可知，LPS-M、LPS-C、LPS-CE均具有還原能力，且隨濃度的增加而增強。在濃度為0.2 mg/mL之前，LPS-M、LPS-C、LPS-CE的還原力增強趨勢不明顯，在0.2 mg/mL之后，隨著LPS濃度的增大還原力明顯增強，由此可知，LPS的還原力與濃度呈正相關(guān)，與Vc還原力相差較大。在濃度為0.02～0.2 mg/mL時，LPS-M、LPS-C、LPS-CE的差異不顯著，0.6 mg/mL時，LPS-M與LPS-CE的差異顯著（p＜0.05）。

3 結(jié)論

3.1 紅外光譜分析結(jié)果表明3種方法提取的蘭州百合多糖在 3378 cm-1、2931 cm-1、1640 cm-1、1060 cm-1都有吸收峰，此為多糖特征吸收峰，表明 LPS-M、LPS-C、LPS-CE均為多糖成分；GC-MS測定結(jié)果顯示，3種多糖的單糖組成均為甘露糖與葡萄糖，但摩爾比發(fā)生了變化，LPS-M、LPS-C、LPS-CE中甘露糖與葡萄糖的摩爾比為分別為5.2:4.9、5.1:4.7、4.8:5.3?？赡芘c微波輻射導(dǎo)致多糖分子的交聯(lián)，以及超聲振動導(dǎo)致糖鏈分子斷裂有關(guān)。

3.2 體外抗氧化活性試驗表明，LPS-CE、LPS-C、LPS-M 在清除羥自由基、超氧自由基的能力依次減弱，且LPS-CE的體外抗氧化活性要遠(yuǎn)高于LPS-M、LPS-C，這可能是由于超聲復(fù)合酶協(xié)同作用時，更快速的將多糖鏈釋放出來，從而使多糖鏈上暴露出的羥基提供更多的質(zhì)子，為自由基提供電子，終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。同時，三者的DPPH自由基和還原力測定也表明，LPS-CE＞LPS-M＞LPS-C。多糖清除羥自由基、DPPH自由基、超氧自由基以及其還原力會影響到蘭州百合多糖在調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤等方面的生物學(xué)活性，因此，可以選擇超聲復(fù)合酶法作為功能性蘭州百合多糖的提取方法。