陸敏 ，常曉婕 ，張文晉 ，2，劉寧 ，2，楊佳美 ，2，劉艷華 ，2，馬學琴 ，2，楊建宏 ，2，余建強 ，2，李鳳梅 ，2

（1.寧夏醫(yī)科大學藥學院，寧夏銀川 750004）（2.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術研究中心,寧夏回醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心,寧夏藥物創(chuàng)新與仿制藥研究重點實驗室，寧夏銀川 750004）

隨著人民生活水平的提高以及人們不良生活習慣的影響，高脂血癥的發(fā)生率呈逐年上升的趨勢，據(jù)2012年全國調查[1,2]結果顯示，中國成人血脂異?？傮w患病率高達 40.4%，其中，高低密度脂蛋白血癥患病率為33.9%；高甘油三酯血癥為13.1%；高膽固醇血癥為4.9%。

血脂[3,4]是對血漿中所含脂類的統(tǒng)稱，主要包括三酰甘油（TG）、膽固醇及其酯（即總膽固醇，TC）、磷脂（PL）以及游離脂肪酸（FFA）等，這些脂類與血漿中的載脂蛋白結合形成乳糜微粒[5]（CM）、極低密度脂蛋白（VLDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C），在血漿中運輸和代謝。當機體在一些內外因素的作用下發(fā)生脂質代謝異常，主要表現(xiàn)為LDL水平升高和HDL水平降低時，導致血脂水平升高并超過正常值，即為高脂血癥（hyperlipidemia）。高脂血癥是中老年人群的多發(fā)疾病，可引起多種嚴重并發(fā)癥，包括動脈粥樣硬化、心肌梗死、腦卒中等一系列心腦血管疾病，這些疾病都是導致人類死亡的主要原因[6]。

研究表明，枸杞可有效降低血清中 TG、TC、LDL-C含量及LDL-C/HDL-C(高密度脂蛋白)比值，具有明顯的降血脂作用[7]；仙人掌可降低高脂血癥小鼠血清TC、TG含量及AI水平，明顯升高HDL-C含量[8,9]；胡蘆巴能顯著降低大鼠血清TG、TC、LDL-C水平[10]。關于枸杞、仙人掌和葫蘆巴這三種植物的復方，還未見報道，寧夏醫(yī)科大學藥學院首次將這三種植物進行科學組方，通過制備工藝研究出香杞平脂咀嚼片（Xiang Qi Lower Blood Lipids Chewable Tablet），已經完成含量測定。本實驗的目的旨在通過建立高脂血癥小鼠模型，初步探究香杞平脂咀嚼片對實驗性高脂血癥小鼠的預防作用，為開發(fā)新的平脂產品提供支持，同時也為香杞平脂咀嚼片合理使用提供初步指導。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 實驗動物及高脂飼料

實驗動物：SPF級健康雄性小鼠60只，體重22±2 g，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（寧）-2016-0001。

高脂飼料配方：膽固醇 1.0%、實驗動物預混料2.0%、磷酸氫鈣 2.0%、大豆分離蛋白 10.0%、豬油12.0%、蔗糖20.0%、維持鼠料53.0%，購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司。

1.1.2 藥物、主要試劑及儀器

香杞平脂咀嚼片，寧夏醫(yī)科大學藥學院聯(lián)合寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術研究中心共同研制，所用輔料皆為食品級別；辛伐他汀片，國藥集團汕頭金石制藥有限公司（171101，20 mg/片）；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津光復精細化工有限公司；生理鹽水，山東齊都藥業(yè)有限公司；總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG) 試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉氨酶(AST)試劑盒都購自南京建成生物工程研究所；AL104電子天平，METTLER TOLEDO；TD5K低速離心機，長沙東旺實驗儀器公司；酶標儀，THermo 1510-00655C；DK-S24型恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備公司；其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 香杞平脂咀嚼片的制備

采用濕法制粒，將枸杞子提取物、仙人掌提取物、葫蘆巴提取物（由于主藥具有強吸潮性，要保證制粒車間的溫濕度不宜過高）與β環(huán)糊精等輔料按比例混合均勻，使用75%乙醇進行制軟材，過14目篩，50 ℃干燥2 h，整粒，添加1%硬脂酸鎂混合均勻后壓片得到香杞平脂咀嚼片。

1.2.2 香杞平脂咀嚼片最大耐受量的測定

采用一次最大限量法，SPF級ICR (20±2) g小鼠40只，雌、雄各半，適應實驗環(huán)境2～3 d。禁食不禁水12 h后，隨機挑選20只(雌、雄各半)按給藥量2 g/kg，給藥體積0.4 mL/10 g經口一次給藥，另20只給予同體積的蒸餾水，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠的毛發(fā)、中毒癥狀及死亡情況。

1.2.3 動物分組及給藥

選用健康雄性SPF級ICR小鼠(22±2) g，60只，于適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為6組：正常對照組，以下簡稱正常組；模型組；模型+辛伐他汀組；模型+香杞平脂咀嚼片（2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg）劑量組，以下簡稱香杞片高、中、低劑量組；于實驗前一天給小鼠禁食不禁水12 h，于每天早晨8:00～9:00灌胃給藥。除正常組飼喂普通飼料外，其余各組均飼喂高糖高脂飼料。同時，給藥組每日分別灌胃香杞片 2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg（溶劑用生理鹽水）；辛伐他汀5 mg/kg（溶劑用0.5% CMC-Na溶液），正常組和模型組每日給予同體積生理鹽水，每次用藥體積均按0.2 mL/10 g計算，各組灌胃1次/d，連續(xù)灌胃6周。每周記錄一次小鼠體重，觀察飲食對小鼠體重的影響。

1.2.4 指標測定

每周記錄一次小鼠體重。末次給藥禁食不禁水12 h后各組小鼠摘除眼球取血，4 ℃冰箱靜置30 min后將血樣低溫離心，3500 r/min，離心15 min，分離血清，密封，-20 ℃冷存待檢。采用試劑盒檢測血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平。

1.2.4.1 血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的檢測

按照生化指標測試試劑盒說明書操作，所有小鼠血清檢測過程避免反復凍融和長時間保存降低酶活力，在取樣當天即開始檢測，若樣品蛋白濃度過高，必要時做適當濃度稀釋后測定。

磷酸甘油氧化酶法(GPO/PAP酶法)測定血清中TG含量，在510 nm處測定吸光度，含量計算方法如下式（1）；COD/PAP酶法測定血清中TC含量，在510 nm 處測定吸光度，含量計算方法如下式（2）；直接法測定血清中LDL-C含量，在546 nm處測定吸光度，含量計算方法如下式（3）；直接法測定血清中HDL-C含量，在546 nm處測定吸光度，含量計算如下式（4）。

1.2.4.2 血清中ALT、AST活力的檢測

按照生化指標測試試劑盒說明書操作，所有小鼠血清檢測過程避免反復凍融和長時間保存降低酶活力，在取樣后立即開始檢測。

微板法測定血清中ALT活力，嚴格按照試劑盒操作進行，先做ALT標準曲線，在510 nm測定各孔OD值，各孔吸光度減零孔吸光度，所得差值等于絕對OD值（=測定孔OD值-對照孔OD值）作為橫坐標，相應的卡門氏單位為縱坐標，作坐標圖擬合公式；按試劑盒操作在510 nm處測定各孔OD值，以絕對OD值為最終數(shù)值，查標準曲線，求得相應的ALT活力單位。

微板法測定血清中AST活力，嚴格按照試劑盒操作進行，先做AST標準曲線，在510 nm測定各孔OD值，各孔吸光度減零孔吸光度，所得差值等于絕對OD值（=測定孔OD值-對照孔OD值）作為橫坐標，相應的卡門氏單位為縱坐標，作坐標圖擬合公式；按試劑盒操作在510 nm處測定各孔OD值，以絕對OD值為最終數(shù)值，查標準曲線，求得相應的AST活力單位。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量結果均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，“n”表示“每組小鼠只數(shù)”，采用單因素方差分析（One-way-anova）多組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗，以p<0.05判斷為有顯著性差異，p<0.01為有極顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 香杞平脂咀嚼片最大耐受量的測定

實驗期間小鼠無任何不良癥狀，飲食、飲水、毛發(fā)及活動均正常，且未出現(xiàn)死亡，根據(jù)最大耐受量的判定，給予小鼠藥物的最大溶解度和最大給藥體積時小鼠未出現(xiàn)死亡的情況下，最大耐受量大于最大給藥量，則小鼠對香杞平脂咀嚼片的最大耐受量大于 2 g/kg。

2.2 香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠體重影響

整個實驗周期內各組小鼠增加的體重在 18～19 g不等，各組間沒有差異（p>0.05），說明在給藥期間各組小鼠生長良好，給藥行為未對小鼠造成不良反應。香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠體重的影響結果見表1。

表1 香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠體重的影響Table 1 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on body weight of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

表1 香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠體重的影響Table 1 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on body weight of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

注：與正常組比較，*表示差異有顯著性（p<0.05），**表示差異有極顯著性（p<0.01）；與模型組比較，#表示差異有顯著性（p<0.05），##表示差異有極顯著性（p<0.01）。

組別 增加的體重/g正常組 18.73±3.28模型組 19.24±4.05模型+辛伐他汀(5 mg/kg) 18.31±2.52模型+香杞片(2 g/kg) 18.20±2.75模型+香杞片(1 g/kg) 19.70±3.818模型+香杞片(0.5 g/kg) 18.27±4.13

2.3 香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的影響

由表2數(shù)據(jù)可知：與正常組相比，模型組TC顯著升高（p<0.05），TG極顯著降低（p<0.01），LDL-C極顯著升高（p<0.01），說明此高脂飼料能夠升高TC和LDL-C但是對HDL-C影響不大，并且降低模型組TG[11]的原因可能是小鼠進食脂肪過多，吸收過少造成肝損傷。并且香杞片高、中和低劑量組TG與正常組相比較差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05），表明香杞片具有能夠使高脂血癥小鼠TG恢復正常的作用。與模型組相比，陽性藥TC極顯著降低（p<0.01）、LDL-C顯著降低（p<0.05），但陽性藥對TG和HDL-C的變化無統(tǒng)計學意義，可能是樣本量過少的原因。香杞平脂咀嚼片的高、中和低劑量均能降低TC和LDL-C，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01或p<0.05），且高劑量組能夠顯著升高HDL-C（p<0.05），各組對TC的降低幅度分別為25.75%、28.85%、12.23%，對LDL-C的降低幅度為37.90%、34.67%、2.42%，對HDL-C的升高幅度分別為73.70%、17.24%、3.92%。結果可知香杞平脂咀嚼片能夠有效改善高脂血癥小鼠血脂。

孫國棟[10]和盧芙蓉等[12]研究的葫蘆巴提取物降低了TG、TC和LDL-C但對HDL-C無明顯影響；饒穎竹等[13]對仙人掌的研究結果顯示降低了TC、TG，升高HDL-C；韋唯[14]將枸杞和沙棘進行復配制備保健品，其中高劑量組降低TC和TG的幅度分別為25.40%和24.50%，升高HDL-C的幅度為18.70%，與之相比，香杞平脂咀嚼片能夠降低37.90%的LDL-C并能增加73.70%的HDL-C。以上研究結果顯示葫蘆巴、仙人掌和枸杞分別具有降血脂作用，而本研究將枸杞、仙人掌和葫蘆巴科學搭配在一起，進行取長補短，研究結果也顯示香杞平脂咀嚼片能夠多方面調控血脂。

表2 香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠血脂水平的影響Table 2 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on blood lipid levels in hyperlipidemia mice (±s, n=10)

表2 香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠血脂水平的影響Table 2 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on blood lipid levels in hyperlipidemia mice (±s, n=10)

注：與正常組比較，*表示差異有顯著性（p<0.05），**表示差異有極顯著性（p<0.01）；與模型組比較，#表示差異有顯著性（p<0.05），##表示差異有極顯著性（p<0.01）。

組別 TG/(mmol/L) TC/(mmol/L) HDL-C/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L)正常組 1.29±0.31 4.87±1.48 2.39±0.60 0.52±0.17模型組 0.81±0.17** 10.33±1.44* 2.32±0.60 1.24±0.24**模型+辛伐他汀(5 mg/kg) 0.92±0.20 6.29±1.29## 3.23±1.06 0.79±0.30#模型+香杞片(2 g/kg) 1.01±0.26## 7.67±0.91# 4.01±0.86# 0.77±0.14##模型+香杞片(1 g/kg) 1.04±0.28# 7.35±1.99# 2.72±0.99 0.81±0.37##模型+香杞片(0.5 g/kg) 1.07±0.21# 9.06±0.94 2.10±0.67 1.21±0.63

2.4 香杞平脂咀嚼片對小鼠肝功能的影響

圖1 香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠AST的影響Fig.1 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on Liver Function in Mice with AST (±s, n=10)

實驗結果可得，與正常組相比：模型組小鼠血清中ALT、AST明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01或p<0.05），表明長期飼養(yǎng)此高脂飼料會對小鼠的肝臟造成嚴重損害。與模型組相比：辛伐他汀組能夠極其顯著的降低 AST和 ALT，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01），表明陽性藥辛伐他汀能夠極其有效的保護肝損傷；而香杞平脂咀嚼片高和中劑量組能夠極顯著降低ALT（p<0.01），各組對ALT的降低幅度分別為42.09%、39.61%、22.56%，對AST的降低幅度分別為25.08%、13.68%、6.19%。

圖2 香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠ALT的影響Fig.2 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on liver function in mice with ALT (±s, n=10)

研究表明枸杞[15]、仙人掌[16]和葫蘆巴[10]均能夠降低ALT和AST活性，具有保護肝損傷的作用。但本研究對AST影響無統(tǒng)計學意義（p>0.05）可能是個體差異或者樣本數(shù)量過少導致，表明香杞平脂咀嚼片具有保護肝的作用。香杞平脂咀嚼片對高脂血癥小鼠肝功能的影響結果見圖1和圖2。

3 結論

3.1 高脂血癥是心腦血管疾病的重要致病因素，臨床資料證實TG升高1 mmol/L，男性心腦血管疾病危險性升高14%，女性則升高37%，TC、LDL-C濃度與心腦血管疾病發(fā)病率也呈正相關，而 HDL-C則與心腦血管疾病的發(fā)病率呈負相關[17]。目前，臨床上主要使用西藥[18,19]進行調節(jié)血脂，這些藥物有一定的降脂作用，但都有較明顯的毒副作用，長期服用易造成肝臟損傷，因此，西藥的副作用仍是高脂血癥治療中的一大難題。比如說，膽汁酸蟹合劑類[20]中的考來烯胺降脂藥，長期使用可引發(fā)高氯酸血癥，可影響脂溶性維生素（A、D、E、K）、葉酸及其他一些弱酸性藥物的吸收。

3.2 本實驗中，通過建立高脂血癥小鼠模型，采用辛伐他汀作為陽性對照藥，探究采用預防治療的方法，驗證香杞平脂咀嚼片在高脂飲食過程中對血脂的調控作用。實驗研究表明，高糖高脂飲食干預只引發(fā)了血清中TC的升高，且差異有顯著性（p<0.01），TG并未升高，則該實驗復制的模型為高膽固醇血癥模型。研究結果表明香杞平脂咀嚼片能降低高脂血癥小鼠血清中TC、LDL-C，提高小鼠血清中HDL-C水平，緩解體內脂質代謝紊亂，有效抑制脂質在肝臟和動脈壁沉積。高脂血癥還可并發(fā)肝臟損傷，轉氨酶[21]是反映肝臟功能的一項指標，其中ALT和AST是最能反映其損傷程度的兩個酶活性指標，轉氨酶是人體代謝過程中必不可少的“催化劑”，主要存在于肝細胞中，當肝細胞發(fā)生炎癥、壞死、中毒等，造成肝細胞受損時，轉氨酶便會釋放入血液里，使血清轉氨酶升高。本實驗研究表明，6周高糖高脂飲食并使得血清中ALT、AST轉氨酶升高，可見已經造成肝細胞損傷，各組ALT、AST活力的差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05或p<0.01），然而喂養(yǎng)了香杞平脂咀嚼片的高脂血癥的小鼠轉氨酶活力明顯降低，證明其具有保護肝細胞的作用。

3.3 美國國家膽固醇教育計劃[22]第 3次報告所提出的血脂異常防治建議方案中，均強調在藥物治療前，應先進行3～6個月的非藥物治療，主要手段包括改變不良生活方式、飲食調節(jié)、戒煙酒及運動鍛煉等措施。香杞平脂咀嚼片從保健品的理念出發(fā)，旨在通過長期服用來預防高脂血癥，避免動脈粥樣硬化的發(fā)生，從而降低心血管疾病發(fā)生的風險。目前針對香杞平脂咀嚼片的研究還不是很廣泛，但這是我們未來的研究方向，旨在通過食療控制疾病的發(fā)生，提高人們的生活質量。