朱偉豪，張維海，海 雯，張凱華，李澤浩，徐興敏，3，4

離子液體(ionic liquid, ILs)是完全由離子組成的在室溫或較低使用溫度(<150 ℃)下呈液態(tài)的鹽，一般由較大的有機(jī)陽離子和較小的無機(jī)陰離子組成[1-2]。由于離子液體具有低揮發(fā)性、高溶解性和強(qiáng)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，被稱為“綠色溶劑”，廣泛應(yīng)用于化學(xué)、化工、環(huán)境和生物等領(lǐng)域[3]。近年來，隨著清潔生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)的要求，有關(guān)離子液體毒性的研究逐漸受到人們廣泛重視[4-6]，離子液體的毒性預(yù)測(cè)方法得到初步建立[7-8]。在離子液體規(guī)模應(yīng)用之前，前瞻性地研究其毒性，具有重要的意義。

有關(guān)咪唑類離子液體的毒性研究已廣見文獻(xiàn)報(bào)道[9-12]，而苯并咪唑類離子液體的毒性研究還少見文獻(xiàn)報(bào)道。苯并咪唑是一種含有兩個(gè)氮原子的苯并雜環(huán)化合物，比咪唑更穩(wěn)定，更易于進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾[13-14]。其衍生物及金屬配合物具有良好的生物活性，有一定抗癌、抗真菌、鎮(zhèn)痛消炎等藥用價(jià)值[15]。本文選擇大腸桿菌作為受試微生物，考察溴化N-丁基-甲基苯并咪唑離子液體對(duì)微生物的毒性作用，為苯并咪唑類離子液體的環(huán)境效應(yīng)評(píng)價(jià)提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器溴化N-丁基-甲基苯并咪唑離子液體(99%，上海成捷化學(xué)有限公司)；大腸桿菌感受態(tài)(DH5α，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；瓊脂粉、胰蛋白胨、氯化鈉、 酵母膏(河南信思分析科技有限公司)。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080型，上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；恒溫培養(yǎng)搖床(HY-45型，武漢匯城生物科技有限公司)；高壓滅菌鍋(XT-S-280A型，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)；生物光學(xué)顯微鏡(XSP-2CA型，上海光學(xué)儀器五廠有限公司)；高精度分析天平(ME104，梅特勒電子天平，上海天平儀器技術(shù)有限公司)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F型，蘇州合飛凈化設(shè)備有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1不同濃度離子液體的配制配制濃度為5.0 mg·mL-1的離子液體母液，依次稀釋為：0.25～5 mg·mL-1(每0.25 mg·mL-1為一濃度梯度)；另取蒸餾水，作為離子液體空白對(duì)照。

1.2.2大腸桿菌菌液配制在無菌操作臺(tái)上將大腸桿菌感受態(tài)接種在固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h。取單個(gè)菌落接種到50 mL液體培養(yǎng)基內(nèi)，放置37 ℃，震蕩200 r·min-1的搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，制得菌液備用。

1.2.3離子液體抑制作用預(yù)實(shí)驗(yàn)取不同濃度離子液體(0～5 mg·mL-1)加入培養(yǎng)基中，進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)離子液體濃度在0.5～2.5 mg·mL-1對(duì)大腸桿菌生長影響明顯(即低于0.5 mg·mL-1與空白對(duì)照沒有明顯區(qū)別，高于2.5 mg·mL-148 h均無肉眼可見菌群生成)。

1.2.4離子液體抑制作用操作過程①培養(yǎng)基制備：取6個(gè)錐形瓶，均加入瓊脂粉0.5 g、胰蛋白胨0.5 g、氯化鈉 0.5 g、酵母膏0.2 g，分別加入50 mL配好的濃度為0、0.5、0.75、1.0、1.5、2.5 mg·mL-1的溴化N-丁基-甲基苯并咪唑離子液，標(biāo)記后震蕩搖勻，調(diào)pH為7.4。②高壓蒸汽滅菌：121 ℃滅菌15 min。③鋪板： 15 mL固體培養(yǎng)基在每個(gè)培養(yǎng)皿中進(jìn)行鋪板冷卻，每個(gè)離子液體濃度設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。④接種：每個(gè)培養(yǎng)皿用接種環(huán)(環(huán)大小直徑一致)以“己”字形順序接種9個(gè)點(diǎn)，3組培養(yǎng)基分別接種。接種后放入37 ℃恒溫箱恒溫倒置培養(yǎng)。⑤每8 h觀察大腸桿菌的生長情況并記錄、拍照。

1.2.5高倍顯微鏡觀察大腸桿菌形態(tài)①涂片；②染色；③鏡檢。

2 結(jié)果

2.1離子液體濃度對(duì)大腸桿菌生長的影響隨著溴化N-丁基-甲基苯并咪唑離子液體濃度的增加，大腸桿菌菌群生長受到抑制，當(dāng)離子液體濃度小于0.5 mg·mL-1時(shí)對(duì)菌群生長影響并不明顯；當(dāng)離子液體濃度達(dá)到0.75 mg·mL-1以上時(shí)，隨著濃度的逐漸增大，離子液體會(huì)逐漸抑制菌群的生長速度，培養(yǎng)48 h生成的菌群斑點(diǎn)明顯減?。划?dāng)離子液體濃度達(dá)到2.5 mg·mL-1時(shí)，培養(yǎng)48 h無肉眼可見菌群斑點(diǎn)形成，見圖1。

A:對(duì)照；B:0.5 mg·mL-1；C:0.75 mg·mL-1；D:1 mg·mL-1;E:1.5 mg·mL-1;F:2.5 mg·mL-1。圖1 不同離子液體濃度對(duì)大腸桿菌生長的影響(培養(yǎng)48 h)

2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大腸桿菌生長的影響對(duì)照組培養(yǎng)8 h即可明顯觀察到大腸桿菌生長形成的斑點(diǎn)，培養(yǎng)24 h后形成厚實(shí)的菌群斑點(diǎn)；而離子液體濃度為0.5 mg·mL-1時(shí)8～16 h僅形成淺淡的菌落斑點(diǎn)，培養(yǎng)24 h以后才形成明顯菌落斑點(diǎn)；離子液體濃度為0.75 mg·mL-1時(shí)，培養(yǎng)8 h只有前6個(gè)點(diǎn)長出，其余3個(gè)點(diǎn)不明顯，16～32 h才形成淺淡斑點(diǎn)，40 h后形成明顯斑點(diǎn)；當(dāng)離子液體濃度為1～1.5 mg·mL-1時(shí)，培養(yǎng)8 h只有前2～4點(diǎn)長出，其余斑點(diǎn)不明顯，8 h后均為淺淡斑點(diǎn)；當(dāng)離子液體濃度達(dá)到2.5 mg·mL-1時(shí)48 h內(nèi)均未形成肉眼可見菌落斑點(diǎn)，見表1。

表1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大腸桿菌生長情況的影響

注：每個(gè)培養(yǎng)皿上接種9個(gè)點(diǎn)，以眼睛觀察辨別生長情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次平行結(jié)果。

2.3離子液體對(duì)大腸桿菌形態(tài)的影響高倍顯微鏡下觀察，隨著溴化N-丁基-甲基苯并咪唑離子液體濃度的增加，大腸桿菌的菌群密度越來越低，但是大腸桿菌的個(gè)體形態(tài)越來越長，比正常大腸桿菌的個(gè)體形態(tài)發(fā)生明顯的變化，見圖2。

A：0 mg·mL-1；B：0.75 mg·mL-1；C：1.5 mg·mL-1；D：2.5 mg·mL-1。A、B、C均培養(yǎng)48 h，D培養(yǎng)96 h；像素：800×600；放大倍數(shù)：1 000。圖2 不同離子液體對(duì)大腸桿菌毒化抑制作用(HE,×1 000)

3 討論

可見溴化N-丁基-甲基苯并咪唑離子液體的毒性與其濃度關(guān)系密切，在一定的濃度范圍內(nèi)，離子液體的毒性隨其濃度的增大而增大。離子液體的濃度對(duì)其毒性的影響規(guī)律為：低濃度時(shí)，其毒性效應(yīng)增加較為緩慢(0.5 mg·mL-1以下)；高濃度時(shí)，離子液體的毒性急速增加(0.75～2.5 mg·mL-1)；但是，當(dāng)濃度繼續(xù)增大時(shí)，其毒性效應(yīng)又趨于平緩(2.5 mg·mL-1以上)。其毒性與濃度之間的關(guān)系表現(xiàn)為“S”型濃度-效應(yīng)曲線，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。

時(shí)間對(duì)大腸桿菌生長的影響規(guī)律表現(xiàn)為：低濃度時(shí)，時(shí)間對(duì)大腸桿菌生長影響顯著，隨著時(shí)間的延長，大腸桿菌菌群成活密度越來越高；高濃度時(shí)(1.0 mg·mL-1以上)，由于受到毒化抑制作用，時(shí)間對(duì)大腸桿菌生長影響逐漸下降，直至無影響。其毒化抑制機(jī)制可能是在高濃度下，由于離子液體的毒化作用，影響了大腸桿菌二分裂，使其在繁殖期菌體內(nèi)物質(zhì)正常復(fù)制，但無法正常分裂成兩個(gè)，只能在兩個(gè)菌體之間形成凹型鏈接(電鏡下可見)。因此隨著繁殖次數(shù)的增加，大腸桿菌不斷地從兩端延長，形成了比正常大腸桿菌形態(tài)明顯改變的菌體。

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，苯并咪唑類化合物是一種活性較強(qiáng)的內(nèi)吸型殺菌劑，其作用機(jī)理是與植物病原的β-微管蛋白結(jié)合，破壞β-微管蛋白的功能，抑制病原菌的有絲分裂和形態(tài)建構(gòu)，而達(dá)到殺菌的目的。此結(jié)論有力地證明了對(duì)其毒性抑制作用機(jī)制的推測(cè)，但有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

總之，通過討論可得到結(jié)論如下：①溴化N-丁基-甲基苯并咪唑離子液體對(duì)大腸桿菌生長有一定的抑制和毒化作用；②隨著溴化N-丁基-甲基苯并咪唑離子液體濃度的增加，其毒化抑制作用增強(qiáng)，但不能完全滅活大腸桿菌；③高濃度下(2.5 mg·mL-1)，由于毒化作用，導(dǎo)致菌體形態(tài)發(fā)生明顯改變。