王延莉，金花子，金海國

（1.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 133000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院畜牧分院，吉林公主嶺 136100）

褪黑素（Melatonin，MT）是由松果體（Pineal Gland）和視網(wǎng)膜光感受器合成的一種吲哚胺。1958年由Lerner從肉牛松果體中首次分離得到，且MT的合成和分泌呈晝低夜高節(jié)律性變化[1]。MT作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌信號，其作用機制復雜，其在調(diào)節(jié)生物的晝夜節(jié)律和季節(jié)性節(jié)律方面有重要作用[2]。季節(jié)性繁殖是動物適應環(huán)境的顯著性特征，它可以讓動物在一年中協(xié)調(diào)生理功能，但它在動物生產(chǎn)方面是一個不受歡迎的復雜因素，需要盡可能避免。前人研究發(fā)現(xiàn)，光周期處理和MT對調(diào)控動物的季節(jié)性繁殖發(fā)揮著重要作用。因此，通過了解MT和動物季節(jié)性繁殖間的聯(lián)系，將有助于研究改造動物固有的季節(jié)性繁殖節(jié)律，從而提高畜牧養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益。

1 褪黑素對季節(jié)性繁殖動物的調(diào)控作用

在長期的進化過程中，哺乳動物形成了季節(jié)性生殖節(jié)律的生活特征，這種通過復雜機制介導的精確繁殖季節(jié)使得動物能夠在每年最適的生殖季節(jié)開始繁殖活動，保證后代出生在一年中最適宜的季節(jié)，便于其更好地生長發(fā)育[3]。季節(jié)性繁殖動物包括長日照繁殖動物（如貓、鼠等）和短日照繁殖動物（如綿羊、鹿等）。前人研究表明，由松果體調(diào)控MT的節(jié)律性分泌能夠調(diào)節(jié)多種動物生殖，尤其是季節(jié)性繁殖動物的生殖活動[4-6]。

1.1 短日照繁殖動物 梅花鹿（Cervus Nippon）是典型的季節(jié)性短日照繁殖動物。對處于非發(fā)情期的母鹿埋植MT，可提高其體內(nèi)卵泡刺激素（Follicle-stimulating Hormone，F(xiàn)SH）的濃度，促進卵泡發(fā)育；同時能顯著增加其體內(nèi)促黃體素（Luteinizing Hormone，LH）含量，有利于促進母鹿達到超排的效果[7]。綿羊（Ovis Aries）發(fā)情多在秋冬季，其繁殖活性與光照時間縮短有關(guān)。當切除綿羊松果體后，這些綿羊無法將繁殖性能與季節(jié)變化同步起來[3]。因此，有人通過皮埋MT試劑模擬短日照的MT分泌模式，發(fā)現(xiàn)MT會促進促性腺激素釋放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH）和LH的脈沖同時釋放，從而刺激母羊的生殖活性，使其提前排卵；然而模擬長日照的MT分泌模式，發(fā)現(xiàn)MT會抑制LH釋放和生殖活動[1]。由此推測，MT是光照周期對LH脈沖釋放的調(diào)控因子。

將短日照繁殖的印第安沙鼠（Meriones Hurrianae）持續(xù)光照1個月，發(fā)現(xiàn)其睪丸萎縮、精子數(shù)量下降，從而抑制了其繁殖能力；但當注射外源性MT后，不僅促進了其睪丸發(fā)育，中和了連續(xù)光照對繁殖的抑制作用，而且附睪等附屬性器官的厚度及表面積也有所增加[8]。以上結(jié)果表明，MT是短日照繁殖動物繁殖的活性因子。1.2 長日照繁殖動物 在長日照季節(jié)里倉鼠（Mesocricetus Auratus）有很強的繁殖活力，在短日照季節(jié)其繁殖性能降至最低。將倉鼠置于在短光照周期下，雄性出現(xiàn)睪丸退化，雌性進入乏情期，倉鼠的繁殖系統(tǒng)受到抑制[3]。對雌大鼠進行松果體切除試驗后，幼年雌鼠的卵巢變肥大，性成熟提前到來，成年雌鼠則出現(xiàn)發(fā)情；當切除雄大鼠的松果體時，幼年雄鼠的睪丸和精囊重量增加；而給雌鼠注射MT后其卵巢重量減輕，性成熟延遲；雄鼠注射MT后睪丸和前列腺出現(xiàn)萎縮[1]。因此，MT有抑制長日照哺乳動物生殖活動的作用，且這種抑制性腺發(fā)育的作用是通過抑制GnRH實現(xiàn)。

家貓（Felis Catus）的卵巢活性隨著光照時間的縮短而靜止，在次年日照變長時才得以恢復[9]。研究顯示，內(nèi)源性MT反向調(diào)節(jié)家貓的發(fā)情周期，抑制雌激素的生成和卵泡生長[10]。MT還會導致家貓LH水平下降，可通過口服或注射外源性MT抑制雌貓卵巢的活性，從而控制貓科動物的生殖[9]。

2 褪黑素調(diào)控動物季節(jié)性繁殖的機理

MT是將光周期與生殖活動協(xié)同起來的重要信號，光照信息對生殖系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用是通過松果體分泌的MT傳遞到下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamo-Pituitary-Gonadal Axis，HPGA）調(diào)節(jié)FSH和LH等激素的釋放，從而影響性腺生殖激素分泌[4,11]。通過外源性MT促進鹿超排，MT可能通過直接與卵巢上的相應受體結(jié)合直接調(diào)節(jié)生殖激素的表達，也可能是通過HPG軸在下丘腦水平上調(diào)節(jié)促性腺激素分泌，從而間接調(diào)控下游生殖系統(tǒng)的活動[7]。以下主要對MT在神經(jīng)內(nèi)分泌水平調(diào)控哺乳動物季節(jié)性繁殖的機制進行簡述。

研究表明，視網(wǎng)膜接收光周期信號后通過視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）傳遞到下游松果體，引發(fā)松果體合成分泌（晝低夜高）MT，并通過甲狀腺激素（Thyroid Hormone，TH）的作用調(diào)控哺乳動物的季節(jié)性繁殖[4]。褪黑激素受體（Melatonin Receptor，MTNR）廣泛分布于垂體結(jié)節(jié)部（Pars Tuberalis， PT）產(chǎn)生促甲狀腺激素（Hyroid Stimulating Hormone，TSH）的特異性細胞上[12]。以MT敏感的C3H小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)TSH是MT在PT區(qū)作用的主要信號目標[13]。而TSH可以與位于下丘腦室管膜細胞上的促甲狀腺激素受體（Thyroid-stimulating Hormone Receptor，TSHR）結(jié)合，從而影響室管膜細胞中脫碘酶2 （type2 deiodinase DIO3）和脫碘酶3（type3 deiodinase DIO3）的表達水平。DIO2可以將四碘甲狀腺原氨酸（Tetraiodothyronine，T4）轉(zhuǎn)化為TH活性更強的三碘甲狀腺原氨酸（Triiodothyronine，T3），而T3和T4會被DIO3鈍化。研究發(fā)現(xiàn)，注射TSH或?qū)⒐庵芷趶亩贪滋熳優(yōu)殚L白天均會導致DIO2的表達顯著上升，而DIO2的上升將TH前體轉(zhuǎn)化為活性形式T3，從而活化促性腺軸[3]。該結(jié)論已在TSHR和MTNR缺失小鼠的研究中得到證實，并對該小鼠注射MT后未影響 DIO2/3的轉(zhuǎn)換[14]。推測MT作用于其受體，并通過 TSH-TSHR通路調(diào)控DIO2/DIO3的表達，繼而調(diào)節(jié)T3/T4水平，調(diào)節(jié)GnRH釋放，最終對動物的繁殖活性進行調(diào)控（圖1）。

圖1 哺乳動物季節(jié)性繁殖調(diào)控通路[15]

哺乳動物的SCN自發(fā)振蕩，直接調(diào)節(jié)Kiss-1神經(jīng)元和RFRP神經(jīng)元的活動。同時，SCN接受視網(wǎng)膜光周期信號將其傳遞給松果體，松果體合成分泌MT，從而影響垂體結(jié)節(jié)部TSH和脫碘酶的表達，進而將TH轉(zhuǎn)化為活性形式T3，調(diào)節(jié)GnRH釋放調(diào)控動物繁殖，也有可能靶向Kisspeptin和RFRP間接調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元的活力，從而調(diào)控繁殖的季節(jié)性變化。

光照周期影響松果體節(jié)律性分泌MT，并通過TH與作用于下丘腦內(nèi)側(cè)基底部（Mediobasal Hypothalamus，MBH）正中隆起上的TH受體作用，在哺乳動物中促性腺激素的釋放完全依賴于GnRH的分泌，而在正中隆起上有GnRH神經(jīng)元末梢的投射[3]。在短光照下，長光照動物GnRH神經(jīng)末梢被神經(jīng)膠質(zhì)細胞的終足包圍；但在長光照下，GnRH神經(jīng)元末梢逃離終足的包圍，且與毛細血管基底膜接觸便于GnRH 釋放入血液[3-4]，從而激活整個HPG軸。除了TH，外源MT或注射TSH都能夠誘導Kisspeptin 和RF酰胺相關(guān)肽（RFamiderelatedpeptides，RFRP）的表達進而調(diào)節(jié)動物季節(jié)性繁殖[16]。總之，TSH和Kisspeptin以及RFRP都由MT響應光信號的變化來調(diào)控生殖軸的季節(jié)變化（圖1）。

3 繁殖節(jié)律相關(guān)基因

季節(jié)性繁殖節(jié)律除了受光照周期的調(diào)控，還受到與繁殖相關(guān)基因的節(jié)律性調(diào)控，這些基因在“光照周期-SCN-MT-GnRH”的通路中，經(jīng)不同通路最終作用于下丘腦GnRH神經(jīng)元，調(diào)控動物的節(jié)律性繁殖過程。

3.1AANAT/HIOMT基因與繁殖季節(jié)性的關(guān)系 芳香烷基胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Arylalkylamine-N-Acetyltran-sferase，AANAT）與羥基吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Hydroxyindole-OMethyltransferase， HIOMT）均高表達于松果體，是合成MT的2個主要酶，參與調(diào)控動物的季節(jié)性繁殖[17]。MT的合成分4個過程：以色氨酸為原料，經(jīng)色氨酸羥化酶（TPH）羥化、5-羥色氨酸脫羧酶（5-HT-POC）脫羧、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT）乙?；?，最終在HIMOT的氧甲基化作用下生成MT。AANAT和HIOMT的合成分泌水平與MT的合成分泌水平同步，且也有晝低夜高的變化節(jié)律[18]。在大鼠松果體中，AANAT白天的活性水平極低，其晝夜活性水平差可達近百倍[19]。

許筱穎等[20]研究表明，大鼠松果腺中AANAT酶活性存在季節(jié)性節(jié)律（冬高夏低），AANAT活性變化規(guī)律與MT分泌量正相關(guān)。黃冬維[21]研究發(fā)現(xiàn)，MT分泌量與AANAT活性變化規(guī)律一致，遼寧絨山羊（季節(jié)性發(fā)情）松果體中AANAT/HIOMT基因表達量顯著高于濟寧青山羊（常年發(fā)情），這可能與兩品種發(fā)情季節(jié)差異有關(guān)。因此，推測AANAT/HIOMT基因是通過介導MT的合成和分泌而進一步對哺乳動物繁殖節(jié)律性進行調(diào)控。

3.2TSHB/DIO2/DIO3基因與繁殖季節(jié)性的關(guān)系 促甲狀腺素B亞基基因（Thyroid- stimulating Hormoneβ-subunit，TSHB）主要在垂體中表達，其協(xié)同TSHR能夠調(diào)節(jié)下丘腦DIO2和DIO3基因的表達，繼而調(diào)控TH（T3、T4、rT3、T2）的動態(tài)平衡，從而調(diào)節(jié)GnRH釋放，最終對動物的繁殖活動進行調(diào)控，TSHB表達與動物季節(jié)性繁殖的光照周期調(diào)控密切相關(guān)[22]。DIO2/DIO3主要表達于下丘腦ARC和下丘腦室管膜細胞，是催化不同活性TH相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，2種脫碘酶的表達變化與哺乳動物的光周期反應有關(guān)，在性腺發(fā)育和季節(jié)繁殖中起重要作用[23]。

研究表明，DIO2/DIO3基因?qū)ρ蚝蛧X動物的季節(jié)性繁殖活動具有重要調(diào)控作用。丁吉順[24]對黑線倉鼠季節(jié)性繁殖探究發(fā)現(xiàn)，DIO2在春秋季表達量較高，其與黑線倉鼠春秋季出現(xiàn)繁殖高峰的事實一致，也與GnRH的季節(jié)表達模式一致，表明DIO2可能有促進調(diào)控黑線倉鼠生殖的作用；而下丘腦DIO3在春秋季表達量較高，睪丸和卵巢DIO3在冬季表達量較高，DIO3在外周性腺與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達不同，推測外周性腺DIO3在冬季的高表達可能是抑制黑線倉鼠的繁殖活動的因子之一。黃冬維等[25]研究發(fā)現(xiàn)，濟寧青山羊垂體DIO2基因表達量顯著高于遼寧絨山羊，下丘腦、卵巢表達量也均高于遼寧絨山羊，子宮表達量卻顯著低于遼寧絨山羊；濟寧青山羊下丘腦DIO3基因表達量明顯高于遼寧絨山羊，而卵巢和子宮DIO3基因表達量卻顯著明顯低于遼寧絨山羊，且遼寧絨山羊垂體DIO3基因表達量高于濟寧青山羊。推測濟寧青山羊常年發(fā)情與其垂體DIO2基因的高表達有關(guān)，同理，遼寧絨山羊季節(jié)性繁殖與其垂體、卵巢和子宮DIO3基因的高表達有關(guān)。TSHB基因在濟寧青山羊和遼寧絨山羊的垂體均高度表達，而濟寧青山羊TSHB基因表達量約為遼寧絨山羊的1.6 倍[21]。

綜上，TSHB/DIO2/DIO3基因表達差異可能反映了動物間發(fā)情季節(jié)性的差別，而季節(jié)性繁殖動物的繁殖節(jié)律性可能是由于垂體TSHB和DIO2基因表達較低或DIO3基因表達較高所致。

3.3Kiss-1/GPR54基因與繁殖季節(jié)性的關(guān)系 Kisspeptin是Kiss-1基因編碼的產(chǎn)物，是位于GnRH神經(jīng)元表面的G蛋白偶聯(lián)受體54（Gprotein-coupled Membrane Receptor 54， GPR54）的內(nèi)源興奮劑，Kisspeptin能強烈刺激性腺軸[26-27]。Kiss-1和GPR54基因敲除的小鼠因具有未成熟的生殖器官及促性腺激素的表達水平很低，因此這些小鼠都不育[12,28]。Kisspeptin和GPR54在調(diào)節(jié)季節(jié)繁殖動物的繁殖活動中發(fā)揮重要作用。在哺乳動物體內(nèi)Kiss-1和GPR54基因廣泛表達，主要表達于下丘腦和胎盤。下丘腦弓狀（ARC）的Kiss-1神經(jīng)元其軸突末梢可直接投射到GnRH神經(jīng)元胞體上，并建立突觸連接[29]，且GPR54轉(zhuǎn)錄物在下丘腦中的GnRH神經(jīng)元表達，表明GnRH神經(jīng)元受Kisspeptin、GPR54直接調(diào)節(jié)（圖1）。在靈長類動物性成熟過程中，下丘腦Kiss-1和在大腦區(qū)域Kisspeptin的釋放表達增加[12,28,30]。注射Kisspeptin會通過GPR54刺激GnRH釋放，使血清LH、FSH水平升高，誘導促性腺軸提前激活，青春期提前到來。以上表明Kisspeptin在HPGA上的關(guān)鍵作用是發(fā)生在GnRH神經(jīng)元上，因此Kisspeptin 被認為是 GnRH最有力的激活者。季節(jié)性繁殖動物的生殖活動受到光周期的嚴格控制。在短日照情況下，MT可以抑制長日照繁殖的嚙齒類動物下丘腦弓狀核分泌Kisspeptin，導致其繁殖活力下降，而注射Kisspeptin可使其繁殖活力恢復[27]；在非繁殖季節(jié)給綿羊注射Kisspeptin能促使90%的母羊排卵[28,31]；黃冬維等[32]研究發(fā)現(xiàn)，濟寧青山羊下丘腦Kiss-1基因表達量顯著高于處于非繁殖季節(jié)的遼寧絨山羊。由此推斷，Kiss-1基因的低水平表達是造成非繁殖季節(jié)生殖活動停止的原因。

3.4RFRP基因與繁殖季節(jié)性的關(guān)系RFRP基因于下丘腦內(nèi)側(cè)基底部（MBH）室旁核（AVPV）、背內(nèi)側(cè)核等廣泛表達，RFRP的表達同樣受光周期的調(diào)節(jié)[33]。在短光照繁殖的綿羊中，長光照下休情期的綿羊與短日照繁殖期的個體相比其RFRP的表達和投射增加[12]。但在嚙齒類中，RFRP的光周期變化卻相反，與長光照下繁殖的敘利亞和西伯利亞倉鼠相比，短光照下休情的倉鼠中RFRP表達量減少；而對光信號不敏感的大鼠，即使將其置于短光照中長達2個月，RFRP表達水平也沒有變化。中等強度的光照可增加西伯利亞倉鼠RFRP的表達[33]。弓形核中Kisspeptin與室旁核中RFRP在控制綿羊節(jié)律性繁殖上發(fā)揮相反作用，在繁殖季節(jié)，Kisspeptin-GnRH接觸更多，來源于Kisspeptin的刺激更多地傳輸給GnRH神經(jīng)元；在非繁殖季節(jié)，RFRPGnRH接觸更少，來源于RFRP的抑制更多傳輸給GnRH神經(jīng)元[33]。Kisspeptin和RFRP作用相反，但彼此相互協(xié)同，調(diào)節(jié)不同季節(jié)下丘腦GnRH神經(jīng)元的活性，使動物繁殖力隨著季節(jié)更替從非繁殖季節(jié)到繁殖季節(jié)的周期性轉(zhuǎn)變[33-34]（圖1）。

光照周期通過MT介導RFRP的表達。與短日照繁殖的綿羊相比，長日照下休情期的綿羊 RFRP 的表達增加；在嚙齒類中，RFRP 的光周期變化卻出現(xiàn)相反模式，與長光照繁殖的倉鼠相比，短光照個體RFRP表達下降[12]，說明RFRP可能在長光照下表達量增加，短光照下表達降低。切除松果體的倉鼠，其RFRP的短光照抑制效應消失，將其置于長光照中并連續(xù)注射MT 60 d，倉鼠RFRP的表達水平下降，達到了與短光照倉鼠水平一樣。綜上，RFRP基因可能是節(jié)律性繁殖的“抑制因子”[33]，但另有研究發(fā)現(xiàn)，濟寧青山羊下丘腦RFRP表達量高于休情期遼寧絨山羊，這與其可能是節(jié)律性繁殖的抑制因子不符[32]。因此，RFRP基因是否對哺乳動物的繁殖節(jié)律有調(diào)控作用或以何種方式調(diào)控還有待進一步研究。

3.5MTNR基因與季節(jié)性繁殖的關(guān)系 MT被認為是季節(jié)性變化的信號傳遞到季節(jié)性繁殖物種的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的主要分子。MT通過其特定的受體MTNR1A和MTNR1B發(fā)揮作用。

3.5.1MTNR1A基因 研究表明，MTNR1A的多態(tài)性與繁殖的季節(jié)性有關(guān)[28]。Chu等[35]用RsaI酶切全年發(fā)情品種山羊和季節(jié)性發(fā)情品種山羊的MTNR1A基因第2外顯子的PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示，全年發(fā)情的濟寧青山羊只檢測到RR基因型，在其他山羊品種中均檢測到RR型和Rr型，未檢測到rr型。分析結(jié)果表明，RR型與山羊全年發(fā)情關(guān)聯(lián)，Rr型與山羊季節(jié)性發(fā)情關(guān)聯(lián)。Muranium等[36]用Rsa I和Mnl I酶切Sarda綿羊MTNR1A第2外顯子擴增片段，以分別檢測T606C和A612G多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)攜帶GG、GA、CC和CT基因型的母羊與AA和TT基因型相比，在引入公羊和分娩之間表現(xiàn)出更高的生育率和更少的天數(shù)。數(shù)據(jù)顯示MTNR1A基因多態(tài)性影響了Sarda綿羊品種季節(jié)性繁殖。Luridiana等[37]用Hpa I對水牛MTNR1A第2外顯子進行酶切，得到CC、CT和TT基因型，CC基因型個體第1次與第2次產(chǎn)犢間隔比CT和TT個體長，表明MTNR1A基因多態(tài)性與水牛的季節(jié)性繁殖活動相關(guān)。

也有研究表明，MTNR1A與動物繁殖季節(jié)性無關(guān)。王瓊等[38]發(fā)現(xiàn)，策勒黑羊的MTNR1A基因不存在多態(tài)性。Hernandez等[39]以12對半同胞成年Ile-de-France母羊為研究對象，發(fā)現(xiàn)MTNR1A基因多態(tài)性與該母羊季節(jié)性繁殖無關(guān)。推測這些多態(tài)性可能受品種或環(huán)境條件影響，也有可能MTNR1A基因?qū)Σ溉閯游锛竟?jié)性繁殖只起微調(diào)作用[40]。

3.5.2MTNR1B基因 由于MTNR1B和MTNR1A基因結(jié)構(gòu)非常相似，有些研究者認為MTNR1B基因也可能對季節(jié)性繁殖具有一定的作用[41]。Von等[42]發(fā)現(xiàn)，在MTNR1A受體靶向缺失的小鼠中，MT對視交叉上核（SCN）多單位活性的急性抑制作用被完全消除。然而，嚙齒動物SCN中的功能性MTNR1B受體部分能夠彌補MTNR1A基因敲除小鼠中MTNR1A受體的缺失。Jin等[43]發(fā)現(xiàn)，MTNR1B基因靶向破壞的小鼠沒有明顯的晝夜節(jié)律表型，MT可以抑制MTNR1B基因敲除小鼠中SCN中的多單位電活性。以上結(jié)果表明，哺乳動物體內(nèi)夜晚分泌的MT使其SCN中內(nèi)源MTNR1B的敏感度降低，從而影響動物生殖。

4 小 結(jié)

光周期協(xié)同MT的內(nèi)源性節(jié)律變化誘導動物形成固定的生殖節(jié)律?！肮庵芷?MT-Kiss-1/GPR54-RFRPGnRH”是調(diào)控動物季節(jié)性繁殖的主要路徑，此類研究正在不斷深入，相信隨著高通量測序分子生物技術(shù)的高速發(fā)展，將會完整地揭示季節(jié)性生殖節(jié)律的調(diào)控機理，改造動物固有的季節(jié)性繁殖節(jié)律將會成為可能，為進一步提高動物的繁殖力和生產(chǎn)性能以及為畜牧業(yè)發(fā)展帶來福音。