李蕓 張立軍 戴海蓉 楊志軍 馬冬妮 楊秀娟 馬駿 苗小樓

摘要：目的??將均譜法用于高烏頭炮制品不同溶劑萃取部分HPLC指紋圖譜研究，為全面評價高烏頭炮制品的質(zhì)量提供參考。方法??采用系統(tǒng)溶劑法對不同產(chǎn)區(qū)高烏頭炮制品95%乙醇提取物進(jìn)行萃取，分別得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水6個不同溶劑萃取部分;采用HPLC于波長235、254、280、290、308 nm檢測，將5個波長HPLC圖譜的信號加和后求平均值作為該萃取部分的均譜;采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對10批高烏頭炮制品不同溶劑萃取部分HPLC均譜進(jìn)行共有峰確認(rèn)及相似度評價。結(jié)果??建立了高烏頭炮制品不同溶劑萃取部分的多波長指紋圖譜（MWCF），高烏頭炮制品石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇及水提部分MWCF分別確定了26、35、22、17、15、25個共有峰，指認(rèn)了2個指紋峰（高烏甲素和冉烏頭堿）。不同產(chǎn)區(qū)高烏頭炮制品同一極性部位MWCF相似度較高，不同極性部位的MWCF有明顯差異，充分表征了有效成分在各萃取部分的分布特征。結(jié)論??本研究建立的MWCF可全面反映高烏頭炮制品不同溶劑萃取部分的化學(xué)成分分布，可為高烏頭炮制品的整體質(zhì)量評價提供參考。

關(guān)鍵詞：高烏頭炮制品;不同溶劑萃取部分;多波長指紋圖譜;均譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.015

中圖分類號：R284.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2018）10-0066-07

Study on HPLC Multi-wavelength Chromatographic Fingerprints of Different Extracts of Processed Aconitum Sinomontanum?Nakai

LI Yun¹， ZHANG Li-jun¹， DAI Hai-rong¹， YANG Zhi-jun²， MA Dong-ni¹，YANG Xiu-juan¹， MA Jun²， MIAO Xiao-lou³

1. Department of Pharmacy， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China; 2. Provincial-Level Key Laboratory for Tibet Herbal Chemicals and Quality Research in Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China; 3. Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutics Discovery， Ministry of Agriculture; Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province， Lanzhou 730050， China

Abstract： Objective?To apply the mean fingerprint method （MFM） for HPLC fingerprints analysis of different extracts of processed Aconitum sinomontanum?Nakai （ASN）; To provide basis for?comprehensive evaluation of ?quality of processed ASN. Methods?Petroleum ether， chloroform， ethyl acetate， n-butanol， alcohol and water extracts?were obtained by means of systematic solvent extraction from 95% ethanol extract of ASN.?Each extract was determined?by HPLC at wavelength of 235， 254， 280， 290， 308 nm， respectively. The signal of the HPLC spectrum ateach of the five extraction wavelengths was summed and then averaged to be the mean fingerprint?of the fraction; Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM?（2012 edition） was used to confirm the common peaks and evaluate the similarity in HPLC mean fingerprints of different extracts of 10 batches of ASN. Results?Multi-wavelength chromatographic fingerprints （MWCF）?of different extracts of ASN was established. 26， 35， 22， 17， 15?and?25 common peaks were determined in MWCF of petroleum ether， chloroform， ethyl acetate， n-butanol， alcohol， and water extracts， respectively. 2 peaks of them were identified?（lappaconitine and aconitine）. The similarity of MWCF in the same polar part of processed ASN?in different producing areas was high， and there are obvious differences in MWCF of different polarities， which fully characterized the distribution characteristics of active ingredients in various extraction parts. Conclusion?Established MWCF for different extracts can?fully reflect the distribution of chemical compositions?of processed ASN， providing a reference for the comprehensive quality evaluation of processed ASN.

Keywords：processedAconitum sinomontanumNakai; different extracts; multi-wavelength chromatographic fingerprints; mean fingerprint method

高烏頭為毛茛科烏頭屬植物高烏頭Aconitum sinomontanum?Nakai的根，是我國中西部地區(qū)民間習(xí)用藥材，現(xiàn)收載于《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，具有祛風(fēng)除濕、理氣止痛、活血散瘀的功效，用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、跌打勞傷、急慢性菌痢等^[1-2]。歷代本草著作均記載“高烏頭辛、苦、溫，有毒”^[3-4]，使其臨床應(yīng)用受到限制。目前，高烏頭的炮制尚無法定標(biāo)準(zhǔn)，本課題組前期對高烏頭炮制工藝^[5]、炮制前后毒性^[6]及藥理作用^[7]進(jìn)行了系列研究，得到合理的炮制工藝，但炮制品的全面質(zhì)量控制還難以實現(xiàn)。中藥指紋圖譜能夠全面反映中藥材及其制劑中所含化學(xué)成分種類和數(shù)量，進(jìn)而反映中藥材及其制劑的質(zhì)量。但是，一方面由于樣品處理大多采用單一溶劑進(jìn)行提取，很難全面反映其化學(xué)成分信息;另一方面，紫外檢測是目前指紋圖譜的主要檢測手段^[8]，而紫外檢測波長單一，大量化學(xué)成分在非最大吸收波長處被檢測導(dǎo)致信號很低，因此，用單一波長指紋圖譜對中藥同時進(jìn)行整體定性和定量分析的結(jié)果具有很大片面性和隨機(jī)性。本研究采用系統(tǒng)溶劑法依次得到高烏頭炮制品6個不同溶劑萃取部分（石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水提部分），進(jìn)行多波長檢測，盡可能使每個萃取部分中重要藥效物質(zhì)在其最大吸收波長處得到較大的吸收，從而獲得主要藥效物質(zhì)的專屬性信號，再對多波長HPLC圖譜數(shù)據(jù)求均譜，使均譜能夠充分表達(dá)不同檢測波長的特征信號，實現(xiàn)從多波長角度最大限度檢測各萃取部分中化學(xué)成分信息，更好地用于高烏頭炮制品的質(zhì)量控制。

1 ?儀器與試藥

BT125D型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），KQ3200DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)W-400A型高建萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司），HHS-11S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠），1100 Series型高效液相色譜儀（美國Agilent科技有限公司，DAD檢測器），SHB-3型循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠），RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限公司）。

高烏甲素對照品（甘肅神龍藥業(yè)股份有限公司，批號20001001，純度≥97.50%），冉烏頭堿對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號150404，純度≥98.00%）;乙腈、甲醇、三乙胺、磷酸二氫鈉為色譜純，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇為分析純。高烏頭藥材分別購于甘肅、青海、西藏等地（見表1），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊扶德教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物高烏頭Aconitum sinomontanum?Nakai的干燥根。將原藥材凈制，潤軟，切制為約5 mm的段，自然干燥，篩去碎屑，得高烏頭飲片。取飲片，用10%甘草汁（每3 mL含1 g甘草）潤透，置立式壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，127 ℃、0.15 MPa蒸制5 h，取出，晾干，篩去碎屑，得高烏頭炮制品^[5]。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?色譜條件

采用DIKMA Spursil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，4%～10%B，流速1.0 mL/min;10～23 min，10%B，流速1.0 mL/min;23～30 min，10%～25%B，流速1.0 mL/min;30～35 min，25%～30%B，流速1.0～0.6 mL/min;45～55 min，30%～35%B，流速0.6 mL/min;55～60 min，35%～50%B，流速0.6 mL/min;60～70 min，50%～60%B，流速0.6 mL/min;70～90 min，60%～80%B，流速0.6 mL/min;90～100 min，80%～100%B，流速0.6～1.0 mL/min;100～110 min，100%B，流速1.0 mL/min），檢測波長分別為235、254、280、290、308 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 ?對照品溶液的制備

精密稱定冉烏頭堿、高烏頭甲素對照品適量，加甲醇制備濃度分別為0.296 0、0.800 4 g/L的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.3 ?不同溶劑萃取部分供試品溶液的制備

取上述10批高烏頭炮制品各500 g，通過已建立的制備方法分別制備6個不同溶劑萃取部分^[9]。分別取上述石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水提萃取部分浸膏質(zhì)量的0.4%（出膏率分別為0.75%、0.56%、0.35%、1.09%、2.62%、23.20%），精密稱定，加甲醇溶解，定容至10 mL，密塞，搖勻，進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 ?不同溶劑萃取部分多波長指紋圖譜的建立

2.4.1 ?空白溶劑考察

取甲醇，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果表明溶劑無干擾。

2.4.2 ?精密度試驗

取三氯甲烷萃取部分供試品溶液（S1），按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，并將色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件計算其相似度，結(jié)果相似度>0.97，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 ?穩(wěn)定性試驗

取三氯甲烷萃取部分供試品溶液（S1），按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，分別于0、3、6、9、12、24 h測定，記錄色譜圖，并將色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件計算其相似度，結(jié)果相似度>0.96，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 ?重復(fù)性試驗

取同一批次樣品粉末（S1），按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并將色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件計算其相似度，結(jié)果相似度>0.94，表明本法重復(fù)性良好。

2.4.5 ?多波長指紋圖譜建立與共有峰標(biāo)定

取10批高烏頭炮制品不同溶劑萃取部分供試品溶液共60份（每批6份），按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。選擇色譜峰信息最豐富的5個波長（235、254、280、290、380 nm）為匹配基準(zhǔn)，實現(xiàn)同一成分在不同波長檢測到的指紋峰完成匹配，若某成分不出峰則積分以0計算，將高烏頭炮制品每個萃取部分5個波長的HPLC圖譜數(shù)據(jù)信號加和后求平均值作為該部分的均譜。將每個溶劑萃取部分的10批均譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件，采用中位數(shù)矢量法進(jìn)行多點校正，生成高烏頭炮制品不同溶劑萃取部分多波長指紋圖譜（MWCF）及對照指紋圖譜（R），以克服單波長檢測獲得的藥物相關(guān)物質(zhì)信息量缺失和檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的缺點^[10-11]。各溶劑萃取部分MWCF共有峰數(shù)目及峰的歸屬結(jié)果見表2?；旌蠈φ掌穲D譜見圖1，5個不同波長10批高烏頭炮制品6個極性部分的HPLC圖譜、MWCF指紋圖譜共有模式分別見圖2～圖7。每批高烏頭炮制品非共有峰總面積與總峰面積的比值均小于10%，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4.6 ?多波長指紋圖譜相似度評價

通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》分析處理，生成高烏頭炮制品指紋圖譜共有模式，得到相似度評價結(jié)果。相似度可體現(xiàn)不同批次樣品之間各成分在種類和相對含量上的相似程度;由于相似度不能反映不同批次樣品間成分絕對含量的差異，所以同時采用總峰面積比（樣品總峰面積/10批樣品平均總峰面積）和相似度2個指標(biāo)共同來對樣品進(jìn)行評價^[12]。10批高烏頭炮制品石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水提部分相似度評價結(jié)果見表3～表8。不同溶劑萃取部分的相似度均大于0.80，表明各批次樣品之間具有較高的相似性;各批次之間總峰面積比不同，表明樣品中的成分含量可能受藥材產(chǎn)地、采集時間的影響。

3 ?討論

本試驗曾采用甲醇-水系統(tǒng)作為流動相，多種梯度洗脫，高烏頭樣品中大部分化學(xué)成分能夠較好分離，但在波長254 nm時基線漂移較為嚴(yán)重，而換用乙腈-水作為流動相效果較好;另外，高烏甲素和冉烏頭堿結(jié)構(gòu)相似，極性相近，很難達(dá)到基線分離，本試驗分別考察了加三乙胺、磷酸二氫鈉等緩沖鹽，結(jié)果顯示采用磷酸二氫鈉-乙腈系統(tǒng)時穩(wěn)定且分離效果良好;同時，本試驗對色譜柱、柱溫、波長等進(jìn)行考察，最終篩選了色譜峰信息較豐富的5個波長（235、254、280、290、308 nm），建立了在同一色譜條件下對高烏頭炮制品不同極性部位化學(xué)成分分析的最佳色譜條件。

目前大部分中藥指紋圖譜研究僅考察了單一極性部分的指紋圖譜，或單一波長的指紋圖譜，忽略了不同極性成分之間的差別，以及不同藥效成分由于結(jié)構(gòu)不同而造成最大吸收不同的影響。本研究采用多波長求均譜的方法建立了高烏頭炮制品不同極性部位的MWCF，從2個方面綜合評價高烏頭炮制品的質(zhì)量。通過對比高烏頭炮制品6個不同溶劑萃取部分MWCF共有模式可清晰觀察到，不同極性部分的化學(xué)成分種類不同，且每個極性部位間化學(xué)成分含量差異明顯。植物類藥材由于生長環(huán)境、氣候、土壤、采集時間等因素的影響，其成分種類和含量也有所不同，表現(xiàn)在色譜圖中則是色譜峰的數(shù)目、保留時間，以及相同保留時間色譜峰峰面積的差異。通過對各極性部分的相似度分析可以看出，不同產(chǎn)區(qū)高烏頭炮制品同一極性部分所含化學(xué)成分?jǐn)?shù)量及含量也存在一定差異，其中石油醚、乙酸乙酯、乙醇及水提部分較為突出，相似度在0.65以上。不同極性部位之間化學(xué)成分有明顯差異，除石油醚、三氯甲烷、水提部分含高烏甲素和冉烏頭堿外，其余3個萃取部分均不含高烏甲素和冉烏頭堿;三氯甲烷萃取部分MWCF的共有峰最多，化學(xué)成分最豐富，主要含有生物堿，其中高烏甲素和冉烏頭堿含量最高^[9]，其次為石油醚、乙酸乙酯和水提部分，正丁醇與乙醇部分共有峰最少。MWCF更全面地展示了高烏頭炮制品不同極性部分化學(xué)成分的分布。

高烏頭辛、苦、溫，有毒，通過甘草汁炮制后毒性明顯降低，鎮(zhèn)痛抗炎作用有增強(qiáng)趨勢，但毒性與藥效成分尚不十分明確。本課題組今后將通過急性毒性實驗、長期毒性實驗及鎮(zhèn)痛抗炎實驗評價高烏頭各極性部分毒性特征與藥效特征，采用灰色關(guān)聯(lián)分析方法和相關(guān)性分析方法計算指紋圖譜共有峰與半數(shù)致死量、最大給藥量及藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度^[13]，以關(guān)聯(lián)度的大小衡量各指紋圖譜共有峰對毒性及對鎮(zhèn)痛抗炎作用的貢獻(xiàn)大小，確定主要毒性成分及鎮(zhèn)痛抗炎成分，揭示高烏頭毒性物質(zhì)基礎(chǔ)與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為高烏頭的炮制加工及臨床應(yīng)用研究提供依據(jù)。

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