王平，孫鐵鋒，國錦，焦園園，劉瑾，趙渤年，高燕

(1.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；2.天津大學(xué)精密測試技術(shù)及儀器國家重點實驗室， 天津 300072；3．山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301600)

痛風(fēng)是由單鈉尿酸鹽(MSU)沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)，包括急性發(fā)作性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石性慢性關(guān)節(jié)炎和尿酸性尿路結(jié)石等疾病，重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)殘疾和腎功能不全。痛風(fēng)中高發(fā)而且危害較重的一種是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，多因尿酸鹽沉積在關(guān)節(jié)囊、滑囊、軟骨、骨質(zhì)和其他組織中而引起病損及炎性反應(yīng)，易發(fā)于40歲以上男性，多見于第一跖趾關(guān)節(jié)，尤其是踝部與足部關(guān)節(jié)[1-2]。隨著中國民眾飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其發(fā)病率連年升高，嚴(yán)重影響著患病人群的生活質(zhì)量[3-5]。痛利舒顆粒為臨床經(jīng)驗方，由茵陳、澤瀉、梔子等十幾味中藥組成，具有清熱利濕、化瘀止痛、益氣滋陰的功效，臨床上能有效緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作期的疼痛。為驗證其療效，我們進(jìn)行了痛利舒顆粒的抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、抗炎和鎮(zhèn)痛實驗研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠90只(雌性，體重18～20 g，許可證號：SCXK(魯)20140007，質(zhì)量合格證號：No：37009200007866)；SPF級KM小鼠70只(雌雄各半，體重18～20 g，許可證號：SCXK(魯)20140007，質(zhì)量合格證號：No：37009200007636)；SPF級SD大鼠70只(雄性，體重180～200 g，許可證號：SCXK(魯)20140007，質(zhì)量合格證號：37009200008127)；均由濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。

1.2 藥品

痛利舒顆粒(山東省中醫(yī)藥研究院中心實驗室課題組提供，批號：20170511；成人日服3次，每次12 g。各項實驗痛利舒顆粒均設(shè)3個劑量組，低劑量組相當(dāng)于臨床等效劑量，中、高劑量組為臨床等效量的2倍和4倍)；痛風(fēng)定膠囊(四川升和藥業(yè)股份有限公司，批號：1611101，成人日服3次，每次1.6 g，實驗所用劑量為其臨床等效量的2倍)；布洛芬片(山東新華制藥股份有限公司，批號：1703067，成人日服2次，每次0.4 g，實驗所用劑量為其臨床等效量的2倍)；吲哚美辛片(上海金不換蘭考制藥有限公司，批號：20160201，成人日服3次，每次25 mg，實驗所用劑量為其臨床等效量)；別嘌醇片(廣州彼迪藥業(yè)有限公司，批號：20170505，成人日服2次，每次0.53 g，實驗所用劑量為其臨床等效劑量)。

1.3 試劑

巴豆油(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：5MXNJ-JQ)；尿酸鈉鹽(Sigma公司，批號：BCBS7438)；生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：1708142704)；戊巴比妥鈉(默克化工技術(shù)(上海)有限公司，批號：20171017)；吐溫80(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20150106)；大鼠血清TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20171009)；大鼠血清IL-6 ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20171009)。

1.4 儀器

YLS-6B型熱板儀(上海精密儀器儀表有限公司)；BT125D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；ENDURA E0541型游標(biāo)卡尺(力易得格林利工具(上海)有限公司)；TDL408型低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；9 mm打孔器。

2 實驗方法

2.1 痛利舒顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的影響

2.1.1 尿酸鈉注射懸液配制

取250 mg 結(jié)晶性尿酸鈉, 加入0.9%氯化鈉注射溶液9 mL，再加1 mL吐溫 80，加熱攪拌，配制成10 mL尿酸鈉混懸溶液，濃度為12.5 mg/mL。

2.1.2 1%戊巴比妥鈉溶液配制

稱取戊巴比妥鈉2.5 g，加至250 mL生理鹽水中，搖勻，即得。

2.1.3 SD大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的制備

采用經(jīng)典Cdoerre急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠造模方法[6-11]。用6號注射針在受試大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)從 45°方向插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，感覺有落空感后，將0.2 mL尿酸鈉溶液(25 mg/mL)注入到踝關(guān)節(jié)腔，以關(guān)節(jié)囊對側(cè)鼓起為造模標(biāo)準(zhǔn)，形成急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型?？瞻讓φ战M注入等體積的生理鹽水-吐溫80。

2.1.4 動物分組與給藥

將造模SD大鼠按體重隨機(jī)分為7組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組，痛風(fēng)定膠囊組，吲哚美辛組，痛利舒高、中、低劑量組(12.96 g/kg、 6.48 g/kg、3.24 g/kg)。各組動物灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對照組和模型對照組均灌胃給予等容量的生理鹽水，灌胃容積10 mL/kg，連續(xù)給藥 7 d。

2.1.5 指標(biāo)測定

2.1.5.1 大鼠足踝關(guān)節(jié)直徑測量

造模前于大鼠右后足踝關(guān)節(jié)上方 1.0 cm處用編號筆作一橫線標(biāo)記，并用游標(biāo)卡尺測量踝關(guān)節(jié)直徑。造模后第一天分別在 4 h、8 h 測量右后足踝關(guān)節(jié)直徑，計算關(guān)節(jié)腫脹度。每天測1次，連續(xù) 7 d。

踝關(guān)節(jié)腫脹程度=造模后踝關(guān)節(jié)直徑-造模前踝關(guān)節(jié)直徑

2.1.5.2 血清IL-6、TNF-α含量的測定

大鼠末次灌胃3 h后，1%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血5 mL，靜置30 min后，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清中 TNF-α、IL-6水平。

2.2 痛利舒顆粒對熱板法測定小鼠痛閾值的影響

2.2.1 實驗動物篩選

KM種小鼠90只，雌性，體重20±2 g，將小鼠置于可調(diào)恒溫?zé)岚鍍x上，溫度控制在55±0.5 ℃，用秒表記錄小鼠自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時間(s)作為該鼠的痛閾值[12-13]。凡痛閾值小于5 s或大于30 s 或喜跳躍者棄之不用。重復(fù)測定其痛閾值2次，取兩次痛閾平均值，作為該鼠給藥前痛閾值。

2.2.2 動物分組與給藥

選擇痛閾值符合實驗要求(5 s<給藥前痛閾值<30 s)的合格小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組 10 只，分別為空白對照組、布洛芬組、痛風(fēng)定組、痛利舒低、中、高劑量組(4.68 g/kg、9.36 g/kg、18.72 g/kg)。各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對照組灌胃給予等容量的生理鹽水，給藥容積25 mL/kg，每日灌胃 1 次，連續(xù)給藥7 d。

2.2.3 指標(biāo)檢測

末次給藥后分別于30、60、90、120 min測定痛閾值1 次，如60 s仍無反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計算。按下列公式計算痛閾提高率：

2.3 痛利舒顆粒對巴豆油所致小鼠耳廓腫脹的影響

2.3.1 2%復(fù)合巴豆油的配制

取巴豆油0.5 mL，無水乙醇5 mL，蒸餾水1.25 mL，乙醚18.25 mL，混勻，即得2%復(fù)合巴豆油溶液25 mL。

2.3.2 實驗分組與給藥

KM小鼠 70 只，適應(yīng)性喂養(yǎng) 3 d后按體重隨機(jī)分為 6組：空白對照組、布洛芬組、痛風(fēng)定膠囊組、痛利舒低、中、高劑量組(4.68 g/kg、9.36 g/kg、18.72 g/kg)。每組 10 只，各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對照組灌胃給予等容量的生理鹽水，給藥容積25 mL/kg，每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.3.3 指標(biāo)檢測

末次給藥1 h后，用微量移液器將2%復(fù)方巴豆油致炎液20 μL均勻涂于每只小鼠的右耳正反兩面致炎[14-15]，左耳不涂作對照，4 h 后脫頸椎處死小鼠，沿著小鼠耳廓基線剪下兩耳，用直徑9 mm 的打孔器分別在兩耳的同一部位打下圓耳片，用電子天平稱重，每鼠的右耳片重量減去左耳片重量即為腫脹程度。計算各組腫脹度之平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，并按公式計算給藥組的腫脹抑制率(%)。

耳腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量，

3 統(tǒng)計學(xué)分析

4 實驗結(jié)果

4.1 痛利舒顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響

造模前，各組大鼠精神佳，進(jìn)食及飲水正常，體重增長正常，毛色白而有光澤。造模后，除空白對照組外，其余各組大鼠精神欠佳，活動減少，進(jìn)食減少，飲水增多，毛色干枯發(fā)暗，體重基本無增長甚至略有減輕。造模后 2 h，除空白對照組外各組大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)明顯的皮膚發(fā)紅，造模處皮膚發(fā)熱，關(guān)節(jié)腫脹，空白對照組關(guān)節(jié)處出現(xiàn)略微腫脹。

由表1結(jié)果可見，造模24 h后，與空白對照組比較，模型對照組踝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯增加，差異具有顯著性意義(P<0.05)，表明急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立成功。造模24、48、72、144 h后，痛利舒高劑量組踝關(guān)節(jié)腫脹程度與模型對照組比較明顯減輕，差異具有極顯著性差異意義(P<0.01)，提示痛利舒高劑量組能明顯改善SD大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹程度。中劑量組和低劑量組在造模24、48、72、144 h后也可以改善踝關(guān)節(jié)腫脹程度，但是部分時間點未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，痛風(fēng)定組可以改善踝關(guān)節(jié)腫脹程度，但沒有顯著性差異(P>0.05)；吲哚美辛片組在144 h與模型組比較具有極顯著性差異(P<0.01)。以上結(jié)果表明，痛利舒顆粒能明顯減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型踝關(guān)節(jié)腫脹程度，具有明顯的抗炎作用。

表1 痛利舒顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響

注: 與空白對照組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

4.2 痛利舒顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清IL-6、TNF-α含量的影響

由表2結(jié)果可見，與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明造模成功。與模型對照組比較，吲哚美辛組、痛風(fēng)定組及痛利舒顆粒低、中、高劑量組均可以明顯降低血清TNF-α、IL-6水平，說明陽性對照藥組及痛利舒各劑量組均可降低尿酸鈉致踝關(guān)節(jié)腫脹大鼠模型的血清中異常升高的TNF-α和IL-6水平。本實驗結(jié)果表明，痛利舒顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠具有良好的抗炎作用。

表2 痛利舒顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清IL-6、TNF-α含量的影響Table 2 Effect of Tonglishu Granule on serum IL-6 and TNF-α contents in rat model of acute gouty

注: 與空白對照組比較#P<0.05,##P<0.01；與模型對照組比較*P<0.05，**P<0.01 。

4.3 痛利舒顆粒對熱板法測定小鼠痛閾值的影響

由表3、表4結(jié)果可見，與空白對照組相比，布洛芬組和痛風(fēng)定組給藥后均表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛作用(P<0.01)。痛利舒顆粒各劑量組末次給藥30 min后，隨著時間和劑量的增加痛閾值也增加，呈正相關(guān)，高劑量組效果最好。其中高劑量組與空白組比較，30、60、90 min時間點痛閾值具有顯著性差異(P<0.05,P<0.01), 120 min時間點沒有顯著性差異(P>0.05)。結(jié)合小鼠痛閾值提高率可以發(fā)現(xiàn)，痛利舒顆粒作用緩和，時間相對持久。綜上所述，痛利舒顆?？梢蕴岣咝∈笸撮撝?，有很好的鎮(zhèn)痛作用。

表3 痛利舒顆粒對熱板法所致小鼠疼痛模型痛閾值的影響

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01 。

表4 痛利舒顆粒對熱板法所致小鼠疼痛模型痛閾提高率的影響Table 4 Effect of Tonglishu Granule on the increase of pain threshold in mouse pain model induced by hot plate method

4.4 痛利舒顆粒對巴豆油所致小鼠耳廓腫脹的影響結(jié)果

實驗過程中小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛光滑，大便正常，墊料隔天更換一次，實驗過程中小鼠無死亡。由表5可見，與空白對照組比較，布洛芬組、痛利舒顆粒中、高劑量組顯示出明顯的抗炎效果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 或P<0.05)，其中陽性對照藥布洛芬的抗炎效果最顯著。痛風(fēng)定組未出現(xiàn)較為明顯的抗炎效果，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但耳腫脹度相比空白對照有下降趨勢。

表5 痛利舒顆粒對巴豆油所致小鼠耳廓腫脹的影響Table 5 Effect of Tonglishu Granule on the swelling of mouse ear caused by croton

注: 與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01 。

5 討論

中醫(yī)認(rèn)為痛風(fēng)屬于“痹癥”，氣血運行不暢，濁瘀滯留關(guān)節(jié)，才會出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥和腫脹等臨床表現(xiàn)。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎為痛風(fēng)發(fā)作期的典型表現(xiàn)，中醫(yī)認(rèn)為，此病多見于青壯年男性，因多食肥甘油膩、酒肉之品，脾運虛弱，濕濁內(nèi)蘊，熱毒內(nèi)結(jié)而發(fā)病。有研究表明，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清及組織里會產(chǎn)生出多種細(xì)胞促炎因子，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等，可促使炎癥范圍不斷擴(kuò)大，發(fā)生關(guān)節(jié)紅腫、皮溫增高、劇烈疼痛以及出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)功能障礙。其中，TNF-α和IL-6為炎癥反應(yīng)出現(xiàn)時較為關(guān)鍵的細(xì)胞因子。TNF-α 是由巨噬細(xì)胞在細(xì)菌感染或免疫源反應(yīng)過程中分泌的小分子蛋白，作為炎性反應(yīng)的重要啟動因子，能促進(jìn)IL-1、IL-6等炎性因子的生成，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對血管內(nèi)皮的粘附性，進(jìn)而形成復(fù)雜的細(xì)胞因子作用網(wǎng)絡(luò)，放大炎性反應(yīng)。IL-6 為巨噬細(xì)胞的激動劑,為經(jīng)典的炎癥因子調(diào)節(jié)劑，控制著炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和分泌, 進(jìn)而加重機(jī)體的炎性反應(yīng)。IL-6可促進(jìn)炎癥相關(guān)的 B 細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞的分化以及急性期蛋白的合成，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，造成關(guān)節(jié)損傷。故本實驗在對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行研究時，著重觀察痛利舒顆粒對關(guān)節(jié)炎大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹程度的改善作用，并測定TNF-α和IL-6的濃度，探究TNF-α和IL-6水平與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系。

痛利舒顆粒為臨床經(jīng)驗方，茵陳、澤瀉、梔子三君藥相合，共奏清熱利水滲濕、止痛解毒之效，丹參、葛根以活血化瘀，牛膝發(fā)揮其引經(jīng)報使之功。全方具有清熱利濕、化瘀止痛、益氣滋陰之效。實驗結(jié)果表明，痛利舒顆粒各劑量組能有效緩解關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，顯著降低大鼠血清中的TNF-α、IL-6水平，提高小鼠的痛閾值，降低小鼠的耳腫脹程度，說明痛利舒顆粒具有良好的消腫鎮(zhèn)痛抗炎作用。綜上所述，痛利舒顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有良好的治療作用，且作用強(qiáng)度與劑量具有一定的量效關(guān)系，但對于降低某些指標(biāo)不如西藥明顯，應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)研究該經(jīng)驗方，探究其在防病、治病方面的新用途或新優(yōu)勢。