余霞，黃卡特，俞富祥

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.病理科；2.肝膽外科）

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[1-3]。Fsp27與細(xì)胞凋亡、能量代謝明顯相關(guān)[4-5]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)Fsp27能夠通過抑制HSCs的活性進(jìn)而在動物活體中具有一定的抗纖維化作用[6]。本研究擬通過探討不同程度肝纖維化患者肝組織中Fsp27的分布、表達(dá)及其與肝纖維化分期、肝纖維化指標(biāo)之間的相關(guān)性，明確Fsp27在臨床肝纖維化進(jìn)展過程中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2015年7月至2017年7月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院因肝臟腫瘤而需行肝部分切除的患者45例，所有病例術(shù)前均行血清肝纖維化指標(biāo)檢測。其中男32例，女13例，年齡36～65歲。病理閱片由2位中級以上職稱的病理科醫(yī)師完成，按照慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[7]的病理分期分為正常組（S0）、輕度肝纖維化組（S1、S2）及重度肝纖維化組（S3、S4），每組15例。本研究獲溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化指標(biāo)檢測及肝臟膠原含量分析：測定各組患者術(shù)前血清III型膠原和透明質(zhì)酸水平，按試劑盒說明（III型膠原試劑盒：上?？祈樕镉邢薰?；血清透明質(zhì)酸定量檢測試劑盒：泉州市藍(lán)圖生物科技有限公司），采用放射免疫法。肝臟羥脯氨酸含量測定，按照試劑盒說明（羥脯氨酸檢測試劑盒：上海盈公生物技術(shù)有限公司），取80 mg肝組織在冰凍條件下勻漿，勻漿液經(jīng)37 ℃孵育消化過夜后，30×g常溫離心并復(fù)溶于測試液中，勻漿液中的羥脯氨酸在550 nm波長處測定OD值，由已知羥脯氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測試液的OD值計算出肝組織內(nèi)的羥脯氨酸濃度。

1.2.2 病理檢測：取各組肝臟行組織切片，肝切片標(biāo)本用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)脫蠟，將脫蠟后的切片置入蘇木精水溶液中染色7 min，酸水及氨水中分色各10 s，流水沖洗1 h后置入蒸餾水5 min，然后于70%及90%的乙醇中各脫水10 min，然后分別進(jìn)行HE染色或Masson染色。HE染色通過乙醇伊紅染色液染色2～3 min。Masson染色通過Masson麗春紅酸性復(fù)紅液浸泡5～10 min。1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，直接用苯胺藍(lán)染5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗2 min。最后切片經(jīng)脫水透明、封片觀察。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色：組織石臘塊切片、脫蠟、二甲苯甲醇脫水、枸櫞酸修復(fù)，F(xiàn)sp27抗體（1:200）孵育過夜，PBS洗滌3次，二抗（兔抗鼠IgG多聚體）37 ℃ 1 h，PBS沖洗3次后，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下拍照。Fsp27單克隆抗體及DAB顯色液均購自武漢博士德公司。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由3位高年資病理科醫(yī)師采用雙盲閱片進(jìn)行判定。該蛋白以HSCs內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，無陽性細(xì)胞為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分。

1.2.4 Real-time PCR檢測Fsp27 mRNA在肝纖維化組織中的水平：取各組患者肝組織標(biāo)本研磨，加Trizol抽提總RNA，設(shè)計針對Fsp27的特異性引物，對反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參。Real-time定量PCR按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，測定RNA的濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照試劑盒說明，PCR反應(yīng)條件為95 ℃變性15 s后，按95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火，共45個循環(huán)。Fsp27的引物序列為上游引物：5’-CCTCTATGACACAT ACTCGCTTTC-3’，下游引物：5-TGTTCTTCCTCAGTGGCA TCC-3’，長度168 bp。

1.2.5 Western blot檢測肝纖維化組織中Fsp27蛋白的表達(dá)：Western blot法按照試劑盒說明提取細(xì)胞蛋白。分別加入現(xiàn)配的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。取一定量蛋白樣品上樣。SDSPAGE膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉緩沖液室溫?fù)u床振蕩1 h，加入抗Fsp27蛋白單克隆抗體（購自美國Abcam公司，1:100），4 ℃過夜，TBST漂洗3次，10 min/次，孵育二抗（1:30 000），37 ℃恒溫振搖1 h；TBST漂洗3次，10 min/次，化學(xué)發(fā)光，顯影、定影，對膠片圖像掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Gel-Pro analyzer分析目標(biāo)帶的灰值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，肝組織Fsp27蛋白染色評分與肝纖維化指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理檢測 與正常組比較，肝纖維化組光學(xué)顯微鏡下可見明顯纖維化，纖維間隔粗厚，假小葉形成，肝細(xì)胞不同程度變性，胞質(zhì)疏松化，并可見透明脂肪液滴分布。見圖1。

2.2 肝臟組織Fsp27蛋白染色 在正常組中，肝組織Fsp27蛋白表達(dá)較強(qiáng)，主要位于肝小葉之間的原代HSLS，而隨著肝纖維化加重，陽性染色逐漸減弱，且范圍也逐漸減少。見圖2。

2.3 Fsp27 mRNA在肝臟組織中的表達(dá)水平 與正常組比較，輕度肝纖維化組和重度肝纖維化組肝臟組織中Fsp27 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與輕度肝纖維化組比，重度肝纖維化組肝臟組織中Fsp27 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 Fsp27蛋白在肝臟組織中的表達(dá)水平 與正常組比較，輕度肝纖維化組和重度肝纖維化組肝臟組織中Fsp27蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與輕度肝纖維化組比，重度肝纖維化組肝臟組織中Fsp27蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖2 3組肝臟病理切片F(xiàn)sp27蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×100）

圖3 3組肝組織中Fsp27 mRNA相對表達(dá)量的比較

2.5 肝組織Fsp27蛋白染色評分與肝纖維化指標(biāo)之間的相關(guān)性 與正常組比，隨著肝纖維化的逐漸加重，血清III型膠原、血清透明質(zhì)酸、肝臟羥脯氨酸含量逐漸升高，F(xiàn)sp27蛋白染色評分逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。Fsp27的蛋白染色評分與肝纖維化的嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)（Fsp27蛋白染色評分與血清III型膠原，r=-0.521，P＜0.05；Fsp27蛋白染色評分與血清透明質(zhì)酸，r=-0.834，P＜0.05；Fsp27蛋白染色評分與肝臟羥脯氨酸，r=-0.667，P＜0.05）。

3 討論

圖4 3組肝組織中Fsp27蛋白相對表達(dá)量的比較

我國是肝炎高發(fā)國家，由肝纖維化導(dǎo)致的肝功能衰竭或肝癌是患者死亡的主要原因。HSCs是肝臟中的脂肪細(xì)胞，HSCs的持續(xù)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。

Fsp27基因作為細(xì)胞凋亡因子家族成員，與脂肪細(xì)胞的分化和成熟密切相關(guān)。眾多研究已顯示促脂基因PPARγ能抑制HSCs活性延緩肝纖維化進(jìn)展[8-10]，而有研究指出Fsp27正是PPARγ對脂肪細(xì)胞發(fā)揮效能的直接下游基因[11]。我們前期研究也已發(fā)現(xiàn)Fsp27在原代HSCs中高表達(dá)，而在活化HSCs中極低表達(dá)或不表達(dá)，在纖維化的肝組織中，外源性增強(qiáng)Fsp27的表達(dá)，也有類似PPARγ延緩肝纖維化的效能[6]。

表1 3組肝組織血清III型膠原、血清透明質(zhì)酸、肝臟羥脯氨酸和Fsp27蛋白染色評分比較（每組15例，±s）

表1 3組肝組織血清III型膠原、血清透明質(zhì)酸、肝臟羥脯氨酸和Fsp27蛋白染色評分比較（每組15例，±s）

與正常組比：aP＜0.05，與輕度肝纖維化組比：bP＜0.05

組別 血清III型膠原（μg/L） 血清透明質(zhì)酸（ng/L） 肝臟羥脯氨酸（μg/g） Fsp27蛋白染色評分正常組 104.3±30.8 82.3±15.1 157.3±17.5 2.7±0.3輕度纖維化組 173.2±22.7a 256.3±37.1a 341.2±37.5a 1.6±0.4a重度纖維化組 237.8±43.3ab 486.3±44.7ab 435.3±70.6ab 1.1±0.4ab F 29.56 86.72 34.91 31.03 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

本研究通過免疫組織化學(xué)染色檢查發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)sp27在正常肝組織中相對強(qiáng)表達(dá)，而隨著肝纖維化加重，表達(dá)強(qiáng)度逐漸降低，而且在肝組織中陽性表達(dá)部位主要位于肝小葉之間的原代HSCs，但隨著肝纖維的逐漸增加，在炎性壞死灶或匯管區(qū)纖維間隔內(nèi)Fsp27的陽性表達(dá)量逐漸減弱。從以上結(jié)果再次驗證了前期研究成果，即Fsp27主要高表達(dá)于原代HSCs，隨著肝纖維化進(jìn)程，肝組織中原代HSCs逐步活化，肝組織中高表達(dá)的Fsp27逐漸低表達(dá)，F(xiàn)sp27與HSCs活化具有直接相關(guān)性。

血清III型膠原與透明質(zhì)酸是臨床上常用的反映肝纖維化情況的非創(chuàng)性檢測指標(biāo)之一，主要由HSCs合成和釋放，是肝臟結(jié)締組織基質(zhì)中的主要成分，被認(rèn)為是判斷肝纖維化程度的較為敏感的檢測指標(biāo)。羥脯氨酸是機(jī)體膠原蛋白的主要特征性成分之一，測定肝臟組織的羥脯氨酸含量，也是反映肝臟纖維化程度的敏感指標(biāo)之一。本研究通過對各不同階段的肝纖維化患者的肝組織Fsp27 mRNA、Fsp27蛋白、肝羥脯氨酸含量及血清肝纖維化指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)sp27在肝臟的表達(dá)強(qiáng)弱與肝纖維化的進(jìn)展程度具有密切聯(lián)系，隨著肝纖維化的逐漸加重，肝臟組織中Fsp27的表達(dá)水平逐漸降低。相關(guān)性分析結(jié)果也顯示，F(xiàn)sp27的陽性表達(dá)評分和反映肝纖維化的指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)。

本研究顯示，F(xiàn)sp27基因不僅能夠抑制HSCs活性、延緩肝纖維化進(jìn)展，而且肝組織中Fsp27的表達(dá)與患者肝纖維化病理的嚴(yán)重程度具有明顯的負(fù)相關(guān)，與肝纖維化常用指標(biāo)（血清III型膠原、透明質(zhì)酸與肝臟羥脯氨酸）也具有很好的負(fù)相關(guān)性。因此，肝組織中Fsp27可作為反映肝纖維化一個很好的負(fù)向指標(biāo)。但是，F(xiàn)sp27通過何種分子通路，如何具體影響HSCs纖維化相關(guān)基因的表達(dá)以及過表達(dá)的Fsp27是否會引發(fā)脂肪肝等，尚待進(jìn)一步研究。