余霞,黃卡特,俞富祥
(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,浙江 溫州 325015,1.病理科;2.肝膽外科)
肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段,肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[1-3]。Fsp27與細胞凋亡、能量代謝明顯相關[4-5],我們前期研究發(fā)現(xiàn)Fsp27能夠通過抑制HSCs的活性進而在動物活體中具有一定的抗纖維化作用[6]。本研究擬通過探討不同程度肝纖維化患者肝組織中Fsp27的分布、表達及其與肝纖維化分期、肝纖維化指標之間的相關性,明確Fsp27在臨床肝纖維化進展過程中的作用。
1.1 一般資料 選取2015年7月至2017年7月在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院因肝臟腫瘤而需行肝部分切除的患者45例,所有病例術前均行血清肝纖維化指標檢測。其中男32例,女13例,年齡36~65歲。病理閱片由2位中級以上職稱的病理科醫(yī)師完成,按照慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[7]的病理分期分為正常組(S0)、輕度肝纖維化組(S1、S2)及重度肝纖維化組(S3、S4),每組15例。本研究獲溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 肝纖維化指標檢測及肝臟膠原含量分析:測定各組患者術前血清III型膠原和透明質酸水平,按試劑盒說明(III型膠原試劑盒:上海科順生物有限公司;血清透明質酸定量檢測試劑盒:泉州市藍圖生物科技有限公司),采用放射免疫法。肝臟羥脯氨酸含量測定,按照試劑盒說明(羥脯氨酸檢測試劑盒:上海盈公生物技術有限公司),取80 mg肝組織在冰凍條件下勻漿,勻漿液經(jīng)37 ℃孵育消化過夜后,30×g常溫離心并復溶于測試液中,勻漿液中的羥脯氨酸在550 nm波長處測定OD值,由已知羥脯氨酸濃度的標準液的OD值建立標準曲線,根據(jù)測試液的OD值計算出肝組織內的羥脯氨酸濃度。
1.2.2 病理檢測:取各組肝臟行組織切片,肝切片標本用10%中性甲醛溶液固定,石蠟包埋,常規(guī)脫蠟,將脫蠟后的切片置入蘇木精水溶液中染色7 min,酸水及氨水中分色各10 s,流水沖洗1 h后置入蒸餾水5 min,然后于70%及90%的乙醇中各脫水10 min,然后分別進行HE染色或Masson染色。HE染色通過乙醇伊紅染色液染色2~3 min。Masson染色通過Masson麗春紅酸性復紅液浸泡5~10 min。1%磷鉬酸水溶液分化3~5 min,直接用苯胺藍染5 min,以0.2%冰醋酸水溶液浸洗2 min。最后切片經(jīng)脫水透明、封片觀察。
1.2.3 免疫組織化學染色:組織石臘塊切片、脫蠟、二甲苯甲醇脫水、枸櫞酸修復,F(xiàn)sp27抗體(1:200)孵育過夜,PBS洗滌3次,二抗(兔抗鼠IgG多聚體)37 ℃ 1 h,PBS沖洗3次后,DAB顯色,光學顯微鏡下拍照。Fsp27單克隆抗體及DAB顯色液均購自武漢博士德公司。免疫組織化學染色結果由3位高年資病理科醫(yī)師采用雙盲閱片進行判定。該蛋白以HSCs內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達,無陽性細胞為0分,<10%為1分,10%~50%為2分,>50%為3分。
1.2.4 Real-time PCR檢測Fsp27 mRNA在肝纖維化組織中的水平:取各組患者肝組織標本研磨,加Trizol抽提總RNA,設計針對Fsp27的特異性引物,對反轉錄cDNA進行real-time PCR反應,以GAPDH為內參。Real-time定量PCR按Trizol試劑盒說明書提取總RNA,測定RNA的濃度及純度,反轉錄反應條件參照試劑盒說明,PCR反應條件為95 ℃變性15 s后,按95 ℃ 5 s變性,60 ℃ 30 s退火,共45個循環(huán)。Fsp27的引物序列為上游引物:5’-CCTCTATGACACAT ACTCGCTTTC-3’,下游引物:5-TGTTCTTCCTCAGTGGCA TCC-3’,長度168 bp。
1.2.5 Western blot檢測肝纖維化組織中Fsp27蛋白的表達:Western blot法按照試劑盒說明提取細胞蛋白。分別加入現(xiàn)配的細胞裂解液,冰上裂解30 min,于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,取上清進行蛋白定量。取一定量蛋白樣品上樣。SDSPAGE膠電泳分離,轉移至PVDF膜,封閉緩沖液室溫搖床振蕩1 h,加入抗Fsp27蛋白單克隆抗體(購自美國Abcam公司,1:100),4 ℃過夜,TBST漂洗3次,10 min/次,孵育二抗(1:30 000),37 ℃恒溫振搖1 h;TBST漂洗3次,10 min/次,化學發(fā)光,顯影、定影,對膠片圖像掃描,用凝膠圖像處理系統(tǒng)Gel-Pro analyzer分析目標帶的灰值。
1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示,3組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK法,肝組織Fsp27蛋白染色評分與肝纖維化指標間的相關性采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 肝組織病理檢測 與正常組比較,肝纖維化組光學顯微鏡下可見明顯纖維化,纖維間隔粗厚,假小葉形成,肝細胞不同程度變性,胞質疏松化,并可見透明脂肪液滴分布。見圖1。
2.2 肝臟組織Fsp27蛋白染色 在正常組中,肝組織Fsp27蛋白表達較強,主要位于肝小葉之間的原代HSLS,而隨著肝纖維化加重,陽性染色逐漸減弱,且范圍也逐漸減少。見圖2。
2.3 Fsp27 mRNA在肝臟組織中的表達水平 與正常組比較,輕度肝纖維化組和重度肝纖維化組肝臟組織中Fsp27 mRNA表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與輕度肝纖維化組比,重度肝纖維化組肝臟組織中Fsp27 mRNA表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。
2.4 Fsp27蛋白在肝臟組織中的表達水平 與正常組比較,輕度肝纖維化組和重度肝纖維化組肝臟組織中Fsp27蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與輕度肝纖維化組比,重度肝纖維化組肝臟組織中Fsp27蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。
圖2 3組肝臟病理切片F(xiàn)sp27蛋白免疫組織化學染色結果(×100)
圖3 3組肝組織中Fsp27 mRNA相對表達量的比較
2.5 肝組織Fsp27蛋白染色評分與肝纖維化指標之間的相關性 與正常組比,隨著肝纖維化的逐漸加重,血清III型膠原、血清透明質酸、肝臟羥脯氨酸含量逐漸升高,F(xiàn)sp27蛋白染色評分逐漸降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。Fsp27的蛋白染色評分與肝纖維化的嚴重程度呈顯著負相關(Fsp27蛋白染色評分與血清III型膠原,r=-0.521,P<0.05;Fsp27蛋白染色評分與血清透明質酸,r=-0.834,P<0.05;Fsp27蛋白染色評分與肝臟羥脯氨酸,r=-0.667,P<0.05)。
圖4 3組肝組織中Fsp27蛋白相對表達量的比較
我國是肝炎高發(fā)國家,由肝纖維化導致的肝功能衰竭或肝癌是患者死亡的主要原因。HSCs是肝臟中的脂肪細胞,HSCs的持續(xù)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵環(huán)節(jié)[2]。
Fsp27基因作為細胞凋亡因子家族成員,與脂肪細胞的分化和成熟密切相關。眾多研究已顯示促脂基因PPARγ能抑制HSCs活性延緩肝纖維化進展[8-10],而有研究指出Fsp27正是PPARγ對脂肪細胞發(fā)揮效能的直接下游基因[11]。我們前期研究也已發(fā)現(xiàn)Fsp27在原代HSCs中高表達,而在活化HSCs中極低表達或不表達,在纖維化的肝組織中,外源性增強Fsp27的表達,也有類似PPARγ延緩肝纖維化的效能[6]。
表1 3組肝組織血清III型膠原、血清透明質酸、肝臟羥脯氨酸和Fsp27蛋白染色評分比較(每組15例,±s)
表1 3組肝組織血清III型膠原、血清透明質酸、肝臟羥脯氨酸和Fsp27蛋白染色評分比較(每組15例,±s)
與正常組比:aP<0.05,與輕度肝纖維化組比:bP<0.05
組別 血清III型膠原(μg/L) 血清透明質酸(ng/L) 肝臟羥脯氨酸(μg/g) Fsp27蛋白染色評分正常組 104.3±30.8 82.3±15.1 157.3±17.5 2.7±0.3輕度纖維化組 173.2±22.7a 256.3±37.1a 341.2±37.5a 1.6±0.4a重度纖維化組 237.8±43.3ab 486.3±44.7ab 435.3±70.6ab 1.1±0.4ab F 29.56 86.72 34.91 31.03 P<0.05 <0.05 <0.05 <0.05
本研究通過免疫組織化學染色檢查發(fā)現(xiàn),F(xiàn)sp27在正常肝組織中相對強表達,而隨著肝纖維化加重,表達強度逐漸降低,而且在肝組織中陽性表達部位主要位于肝小葉之間的原代HSCs,但隨著肝纖維的逐漸增加,在炎性壞死灶或匯管區(qū)纖維間隔內Fsp27的陽性表達量逐漸減弱。從以上結果再次驗證了前期研究成果,即Fsp27主要高表達于原代HSCs,隨著肝纖維化進程,肝組織中原代HSCs逐步活化,肝組織中高表達的Fsp27逐漸低表達,F(xiàn)sp27與HSCs活化具有直接相關性。
血清III型膠原與透明質酸是臨床上常用的反映肝纖維化情況的非創(chuàng)性檢測指標之一,主要由HSCs合成和釋放,是肝臟結締組織基質中的主要成分,被認為是判斷肝纖維化程度的較為敏感的檢測指標。羥脯氨酸是機體膠原蛋白的主要特征性成分之一,測定肝臟組織的羥脯氨酸含量,也是反映肝臟纖維化程度的敏感指標之一。本研究通過對各不同階段的肝纖維化患者的肝組織Fsp27 mRNA、Fsp27蛋白、肝羥脯氨酸含量及血清肝纖維化指標的研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)sp27在肝臟的表達強弱與肝纖維化的進展程度具有密切聯(lián)系,隨著肝纖維化的逐漸加重,肝臟組織中Fsp27的表達水平逐漸降低。相關性分析結果也顯示,F(xiàn)sp27的陽性表達評分和反映肝纖維化的指標呈顯著負相關。
本研究顯示,F(xiàn)sp27基因不僅能夠抑制HSCs活性、延緩肝纖維化進展,而且肝組織中Fsp27的表達與患者肝纖維化病理的嚴重程度具有明顯的負相關,與肝纖維化常用指標(血清III型膠原、透明質酸與肝臟羥脯氨酸)也具有很好的負相關性。因此,肝組織中Fsp27可作為反映肝纖維化一個很好的負向指標。但是,F(xiàn)sp27通過何種分子通路,如何具體影響HSCs纖維化相關基因的表達以及過表達的Fsp27是否會引發(fā)脂肪肝等,尚待進一步研究。