胡蘭蘭，陳佳君，陳君第霞，潘曉瓊，胡臻

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325027）

血管內(nèi)皮功能障礙是血管內(nèi)皮損傷的早期表現(xiàn)與始動(dòng)因素，在動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生與發(fā)展中起著促進(jìn)作用[1]，防治血管內(nèi)皮功能障礙成為了目前防治AS的研究熱點(diǎn)。黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是中藥黃芪中的活性成分之一，研究表明APS可以促進(jìn)一氧化氮（nitric oxide，NO）的生成，改善血管內(nèi)皮功能障礙[2-3]，然而其相關(guān)機(jī)制尚未完全清楚。NO的生成主要受一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和NADPH氧化酶（NADPH oxidase，Nox）的活性影響。研究證實(shí)磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）以及Akt為eNOS的上游激酶，可以激活eNOS，產(chǎn)生NO[4]，目前許多研究發(fā)現(xiàn)APS可以活化AMPK以及Akt蛋白[5-7]，而當(dāng)上調(diào)Nox活性，可以增加NO的滅活[8]。本研究以棕櫚酸誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，探討APS對內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO生成的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 APS購于美國ATCC公司，HUVECs株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基及棕櫚酸購于美國Sigma公司，NO試劑盒購于南京建成科技有限公司，Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于美國Inritrogen公司，RNA提取試劑盒購于美國Ambion公司，Nox4、eNOS、β-actin引物合成于美國Invitrogen公司，人Nox4、AMPK、P-AMPK抗體購于美國Proteintech公司，人eNOS、p-eNOS抗體購于上海ABclonal公司，p-Akt、GAPDH抗體購于德國CST公司，所有二抗均購于美國Santa Cruz公司，ECL曝光液試劑盒購于上海碧云天生物公司。

1.2 細(xì)胞生存率檢測 選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)板技術(shù)，按每孔5×103個(gè)細(xì)胞將HUVECs種植到96孔板中，每組設(shè)置個(gè)6個(gè)副孔，實(shí)驗(yàn)組分別加入400 mg/L（A組）、800 mg/L（B組）、1 600 mg/L（C組）APS溶液，對照組加入等體積PBS溶液，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)放置在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)4 h后，吸干每孔溶液，加入100 μL的二甲基亞砜（DMSO）溶液，于酶標(biāo)儀下檢測460 nm波長的吸光度。細(xì)胞生存率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.3 建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型及實(shí)驗(yàn)分組 HUVECs用DMEM高糖培養(yǎng)基加10%胎牛血清及100 U/mL青霉素G在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取4～8代HUVECs用于實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞生長到70%～80%融合時(shí)，加入250 mmol/L的棕櫚酸共同孵育，建立HUVECs損傷模型，并將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、模型組、APS 400（加入400 mg/L APS）組、APS 800（加入800 mg/L APS）組、APS 1600（加入1 600 mg/L APS）組，按不同濃度要求依次加入等體積的APS溶液共同孵育24 h。

1.4 MTT試驗(yàn)檢測APS的細(xì)胞毒性 選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)板技術(shù)，按每孔5 000個(gè)細(xì)胞將HUVECs種植到96孔板中，每組設(shè)置個(gè)6個(gè)副孔，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度APS溶液，對照組加入等體積的PBS溶液，培養(yǎng)24 h。每孔按要求加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)放置在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)4 h后，吸干每孔的溶液，加入100 μL的DMSO溶液，于酶標(biāo)儀下檢測460 nm波長的吸光度。

1.5 Western blot檢測 收集各組細(xì)胞，棄去上清液，PBS溶液清洗3遍，加入細(xì)胞裂解液后，12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，酶標(biāo)儀595 nm處測定蛋白濃度，取樣加入上樣緩沖液，沸水中煮10 min，取70 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，待電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用含有5%脫脂奶粉的TBS溶液常溫?fù)u床封閉1.5 h，1×TBST溶液清洗3次/5 min后，加入相應(yīng)一抗溶液，冰箱搖床孵育過夜，1×TBST溶液清洗3次/7 min，加入相應(yīng)二抗溶液，孵育1 h，1×TBST溶液清洗3次/5 min，biorad凝膠成像系統(tǒng)下ECL孵育顯影，檢測指標(biāo)為：AMPK、p-AMPK、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Nox4、GAPDH。

1.6 Q-PCR檢測eNOS、NOX4 mRNA的表達(dá) 取各組細(xì)胞，提取RNA：①棄去上清，加入1 mL Trizol充分裂解細(xì)胞；②加入200 μL氯仿，靜置3 min，12 000 r/min、4 ℃下離心10 min；③溶液靜置10 min后，加入500 μL異丙醇，顛倒混勻，12 000 r/min、4 ℃下離心15 min；④棄去上清，加入1 mL無水乙醇，洗滌沉淀，7 500 r/min、4 ℃下離心5 min。合成cDNA：①酶標(biāo)儀260、280 nm雙波長下測定RNA濃度與純度，滅菌水配平；②按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，依次加入Oligo（dT）試劑、dNTP試劑、提取的RNA、DTT試劑及M-MLV酶反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR定量及分析：方法參照熒光定量試劑盒說明書，加入合成DNA、SYBR染料、引物以及滅菌水，設(shè)置好PCR儀的溫度與循環(huán)，進(jìn)行PCR定量，最后采用Mastercyler ep realplex檢測系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。檢測指標(biāo)為：eNOS、NOX-4及β-actin。

1.7 硝酸酶還原法檢驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)NO含量 NO化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡谌梭w內(nèi)很快轉(zhuǎn)化為NO2-，再轉(zhuǎn)化為NO3-，本實(shí)驗(yàn)利用硝酸酶的還原特異性將NO3-還原成NO2-，通過顯色深淺來間接測定NO濃度的高低。收集以上各組細(xì)胞懸液，按NO試劑盒說明書進(jìn)行具體操作，采用酶標(biāo)儀測定各組550 nm，0.5 cm光徑處的吸光度值。按照以下公式計(jì)算NO含量：NO含量（μmol/L）=（測定管吸光度-空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)吸光度-空白吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（100 μmol/L）×樣品測試前稀釋前倍數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad7.0和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同溶度APS對HUVECs相對生存率的影響 各濃度APS（400 mg/L、800 mg/L）細(xì)胞生存率均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且相對生存率均大于100%；黃芪多糖在一定濃度范圍內(nèi)（＜1 600 mg/L）能促進(jìn)HUVECs增殖并無明顯細(xì)胞毒性。見表1。

表1 不同濃度的APS溶液對HUVECs相對生存率的影響（每組n=6，±s）

表1 不同濃度的APS溶液對HUVECs相對生存率的影響（每組n=6，±s）

與對照組比：aP＜0.05

組別 細(xì)胞相對生存率（%）對照組 95.07±1.31 A組 102.80±2.40a B組 106.20±4.21a C組 102.40±5.49

2.2 APS對HUVECs內(nèi)AMPK、p-AMPK、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Nox4蛋白表達(dá)的影響 棕櫚酸可以抑制HUVECs內(nèi)p-AMPK、p-Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)，上調(diào)Nox4蛋白的生成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；

NO是維持血管內(nèi)皮正常生理功能的重要因子，其生物活性下降會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張功能損害，促進(jìn)AS的形成[9]，目前被認(rèn)為是機(jī)體對抗AS的第一道防線。NO主要由細(xì)胞內(nèi)eNOS合成，p-eNOS的Ser1177位點(diǎn)可以激活eNOS，產(chǎn)生NO。而最新的研究表明AMPK作為細(xì)胞內(nèi)能量感受器，是eNOS的上游激酶，能夠促進(jìn)eNOS Ser1177位點(diǎn)的磷酸化，活化eNOS，促進(jìn)NO的生成[10]。另外，Akt蛋白也被認(rèn)為是調(diào)節(jié)eNOS活性功能的酶，p-Akt的Ser/Thr位點(diǎn)可以激活eNOS，促進(jìn)NO的產(chǎn)生[11]。而NO的滅活主要與Nox的活性有關(guān)，Nox4是Nox表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上的一種主要亞型，是血管內(nèi)皮細(xì)胞O2-的主要來源，Nox4表達(dá)上調(diào)或活性增加可以使O2-產(chǎn)生增多，O2-而加入APS干預(yù)后，HUVECs內(nèi)p-AMPK、p-Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)較模型組上調(diào)，且APS 1600組與比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；eNOS蛋白表達(dá)量升高，Nox4蛋白表達(dá)量降低，且APS 800組和APS 1600組與模型組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1-2。

圖1 不同濃度的APS溶液對棕櫚酸損傷的HUVECs內(nèi)p-AMPK、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Nox4蛋白表達(dá)的影響

2.3 APS對HUVECs的eNOS、Nox4 mRNA表達(dá)的影響

用棕櫚酸刺激HUVECs后，與對照組相比模型組細(xì)胞內(nèi)eNOS mRNA表達(dá)下降、Nox4 mRNA的表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而用APS干預(yù)后，與模型組相比3個(gè)APS組細(xì)胞內(nèi)eNOS mRNA的表達(dá)上升、Nox4 mRNA的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 APS對HUVECs內(nèi)NO含量的影響 用棕櫚酸刺激HU-VECs后，模型組HUVECs內(nèi)的NO含量較對照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與模型組比，用不同濃度的APS干預(yù)作用后，HUVECs內(nèi)的NO含量隨著APS的濃度增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

圖2 不同濃度的APS溶液對棕櫚酸損傷的HUVECs內(nèi)p-AMPK、p-Akt、p-eNOS、eNOS、Nox4蛋白相對光 密度的影響

表2 APS對棕櫚酸損傷的HUVECs內(nèi)eNOS、Nox4 mRNA表達(dá)的影響（每組n=6，±s，%）

表2 APS對棕櫚酸損傷的HUVECs內(nèi)eNOS、Nox4 mRNA表達(dá)的影響（每組n=6，±s，%）

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05

組別 eNOS mRNA Nox4 mRNA對照組 100 100模型組 46.74± 5.71a 273.0±17.28a APS 400組 93.08±10.43b 207.2±20.33b APS 800組 126.50±12.74b 153.1±21.38b APS 1600組 214.90±26.87b 136.8±19.44b

表3 APS對棕櫚酸誘導(dǎo)的HUVECs上清液中NO含量的影響（每組n=6，±s）

表3 APS對棕櫚酸誘導(dǎo)的HUVECs上清液中NO含量的影響（每組n=6，±s）

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05

組別 NO（μmol/L）對照組 77.97±4.97模型組 38.02±6.69a APS 400組 55.67±1.25b APS 800組 62.41±1.90b APS 1600組 70.98±4.09b

可迅速與NO結(jié)合生成氧化能力更強(qiáng)的ONOO-，導(dǎo)致NO滅活增多，引起其生物活性下降，因此，Nox4的活性在內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷中也起決定性作用。

APS是從中藥黃芪中提取的一種有效活性成分，目前研究發(fā)現(xiàn)APS可以提高異丙腎上腺素誘導(dǎo)的肥厚大鼠內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO的含量，起到保護(hù)內(nèi)皮功能障礙的作用[12]，APS可以促進(jìn)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO的生成，改善內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧狀態(tài)和缺氧損傷，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[13]。然而APS影響NO生成的調(diào)控機(jī)制目前并未完全闡明。而目前許多研究證實(shí)APS可以活化AMPK以及Akt蛋白，因此APS是否可以促進(jìn)AMPK、Akt蛋白的活化、激活eNOS，產(chǎn)生NO以及APS是否可以通過調(diào)節(jié)Nox活性，減少NO滅活來達(dá)到其防治內(nèi)皮功能障礙的作用，是本研究的主要內(nèi)容。

本研究以棕櫚酸誘導(dǎo)HUVECs來建立血管內(nèi)皮損傷細(xì)胞模型。棕櫚酸作為一種飽和游離脂肪酸，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與炎癥因子釋放，造成內(nèi)皮損傷，并且促進(jìn)AS的發(fā)展[14-16]。因此，實(shí)驗(yàn)采用棕櫚酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從細(xì)胞層面上觀察APS對AMPK、Akt、eNOS及Nox4蛋白活性表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)NO含量的影響，探索其改善血管內(nèi)皮功能障礙、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用棕櫚酸刺激HUVECs后，細(xì)胞內(nèi)p-AMPK、p-Akt、p-eNOS蛋白以及eNOS mRNA表達(dá)下降，Nox4蛋白及Nox4 mRNA的表達(dá)上升，細(xì)胞內(nèi)NO的含量降低，這些可以證明血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型誘導(dǎo)成功。而用APS干預(yù)后，能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Akt以及AMPK蛋白的磷酸化，緩解棕櫚酸對細(xì)胞內(nèi)eNOS活性的抑制，激活eNOS，促進(jìn)NO的生成，并且下調(diào)Nox4的表達(dá)，減少NO的滅活，提高其生物活性。

綜上，APS可以上調(diào)櫚酸誘導(dǎo)HUVECs內(nèi)p-AMPK、p-Akt、p-eNOS蛋白以及eNOS mRNA的表達(dá)，下調(diào)Nox4蛋白及Nox4 mRNA的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)NO的生成，達(dá)到緩解內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制可能與其能活化細(xì)胞內(nèi)AMPK及Akt蛋白，激活eNOS，降低Nox4的表達(dá)有關(guān)。