徐惠琴，杜延茹，沈晶贊，林嘉禾，丁思琦，鄭榮遠，王新施，王莉，葉朦倩

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

癲癇?。╡pilepsy）是危及人類健康的常見疾病，大腦皮層神經(jīng)元過度同步放電是其發(fā)病的電生理基礎(chǔ)[1-2]。N-甲基-D天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的興奮性谷氨酸受體[3-5]。研究表明，谷氨酸大量蓄積時可以過度激活神經(jīng)元膜上的NMDA受體，從而引起Ca2+內(nèi)流，細胞內(nèi)與Ca2+相關(guān)的信號通路過度激活，神經(jīng)元異常放電；神經(jīng)元異常高頻放電導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路異常激活及癲癇發(fā)作；反復(fù)的癲癇發(fā)作損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[6-9]。在急性癲癇持續(xù)狀態(tài)動物模型[10-11]和在離體海馬神經(jīng)元細胞實驗[12]中分別發(fā)現(xiàn)選擇性阻斷NMDA受體NR2A亞基具有抗驚厥作用，而選擇性阻斷NR2B亞基則無上述作用，提示NR2A、NR2B亞基在癲癇發(fā)生過程中作用不同。但是在慢性癲癇模型中，關(guān)于NR2A、NR2B亞基作用的研究較少。因此，本研究通過構(gòu)建戊四氮（pentetrazol，PTZ）誘導(dǎo)慢性癲癇大鼠模型并選擇性阻斷NR2A、NR2B亞基，探究其在慢性癲癇中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和分組：48只清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。大鼠在室溫（23±1）℃，濕度50%±5%，自然光照，晝夜節(jié)律，自由攝食飲水條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后隨機分為5組：Control組8只，PTZ組、PTZ+MK-801（NMDA非選擇性受體拮抗劑）組、PTZ+NVP（選擇性NR2A亞基拮抗劑）組、PTZ+Ifenprodil（選擇性NR2B亞基拮抗劑）組各10只。

1.1.2 主要藥物和試劑：PTZ和MK-801購于美國Sigma公司，NVP-AAM077（NVP）和Ifenprodil購于美國MCE公司，DMSO購于上海翊圣生物科技有限公司。PTZ、MK-801、NVP均用0.9%氯化鈉溶液配制；Ifenprodil先溶于DMSO，分裝后-20 ℃保存，使用時用0.9%氯化鈉溶液稀釋。一抗R2A、R2B購于英國Abcam生物公司，二抗兔IgG-免疫組織化學試劑盒SABC即用型和DAB顯色液購于北京博士德生物公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所，尼氏染色液購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 慢性癲癇模型：連續(xù)腹腔注射35 mg/kg PTZ共28 d構(gòu)建慢性癲癇大鼠模型。注射PTZ 0.5 h前，Control組、PTZ+MK-801組、PTZ+NVP組、PTZ+Ifenprodil組分別注射等劑量0.9%氯化鈉溶液、0.1 mg/（kg·d） MK-801、5.0 mg/（kg·d） NVP、10 mg/（kg·d） Ifenprodil。

1.2.2 行為學觀察記錄：在PTZ注射后1 h內(nèi)按照Racine分級標準每天記錄驚厥發(fā)作評分。分級標準：0級，無運動性癲癇發(fā)作活動；1級，節(jié)律性嘴和面部抽動；2級，點頭或甩尾；3級，單肢抽動；4級，多肢抽動或強直；5級，全面性強直陣攣發(fā)作；6級，死亡。連續(xù)3 d出現(xiàn)4級及以上發(fā)作視為完全點燃。

1.2.3 石蠟切片制備：于第29天用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)心臟先后灌注0.9%氯化鈉溶液、4%多聚甲醛后取腦組織于4%多聚甲醛固定6 h，脫水、透明、浸蠟、包埋。冠狀位連續(xù)海馬切片，切片厚度為4 μm。

1.2.4 尼氏染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元：切片常規(guī)脫蠟至水后將切片浸入Cresyl violet Stain，并將染缸于56 ℃恒溫箱1 h，去離子水沖洗后置于Nissl Differentiation中分化2 min，脫水，二甲苯透明2次，每次3 min，中性樹膠封片。每只大鼠隨機選擇2張切片在顯微鏡下觀察。于4倍鏡下觀察各組大鼠海馬整體形態(tài)，于400倍鏡下對各組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)相同部位進行神經(jīng)元計數(shù)。

1.2.5 Western blot法測定大鼠海馬NR2A、NR2B亞基水平：第29天用5%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉處死，取新鮮海馬組織于-80 ℃冰箱中保存。剪取50 mg左右的組織，加入300 μL的裂解液，置于冰上用剪刀剪碎，置于冰上裂解30 min，每隔10 min震蕩混勻，4 ℃，13 000 r/min離心10 min，取上清分裝于1.5 mL離心管中并置于-80 ℃保存，Western blot檢測前采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定及蛋白變性處理（100 ℃沸水浴煮蛋白5 min），采用12%分離膠和5%濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔蛋白上樣量為20 μg，電泳結(jié)束后依次進行轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃一抗孵育過夜，洗膜3次，室溫孵育二抗2 h，洗膜3次，ECL化學發(fā)光顯影和TIF格式導(dǎo)出后在Image J軟件下分析各條帶光密度。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析，并用GraphPad Prism7.0軟件作圖。所有數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 點燃情況及行為學評分 所有PTZ注射大鼠在15 d后達到完全點燃狀態(tài)，各組點燃情況見表1。與PTZ組比，PTZ+MK-801組、PTZ+NVP組每日平均發(fā)作評分明顯降低，MK-801和NVP可以減輕PTZ誘導(dǎo)慢性癲癇大鼠的驚厥發(fā)作強度，而Ifenprodil無此作用，見圖1。

表1 各組大鼠點燃情況

2.2 各組大鼠海馬神經(jīng)元丟失情況 切片經(jīng)尼式染色，4倍鏡下，各組大鼠海馬整體形態(tài)都存在。400倍鏡下，對海馬分區(qū)進行神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果如下：與Control組比，PTZ組、PTZ+MK-801組、PTZ+NVP組和PTZ+Ifenprodil組海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)神經(jīng)元都有不同程度的丟失；與Control組比，PTZ組海馬神經(jīng)元大量丟失（CA1區(qū)：P＜0.05；CA3區(qū)：P＜0.01；DG區(qū)：P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。相較PTZ組，MK-801、NVP和Ifenprodil均能減少海馬神經(jīng)元丟失；其中，MK-801、NVP減輕神經(jīng)元損傷效果顯著，以CA1區(qū)（P＜0.05）和DG區(qū)（P＜0.05）最明顯；而Ifenprodil作用不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（各區(qū)P＞0.05）。見圖2。

圖1 各組大鼠行為學評分比較

圖2 尼氏染色海馬神經(jīng)元丟失情況

2.3 Western blot檢測海馬NR2A、NR2B亞基水平與Control組比，PTZ組海馬NR2A、NR2B亞基水平均下降（P＜0.05）。NR2A亞基水平，PTZ+NVP組高于PTZ組（P＜0.01），PTZ+MK-801組、PTZ+Ifenprodil組與PTZ組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。NR2B亞基水平，PTZ+MK-801組、PTZ+NVP組和PTZ+Ifenprodil組均高于PTZ組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Western blot檢測各組海馬NR2A、NR2B亞基水平

3 討論

癲癇的發(fā)病機制復(fù)雜，目前主要認為是由于中樞性神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性與抑制性失衡所致，而其與神經(jīng)遞質(zhì)失衡、離子通道、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、遺傳及免疫的異常有密切關(guān)系[13]。其中，谷氨酸與γ-氨基丁酸分別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，并與癲癇發(fā)作密切關(guān)系[14-15]。PTZ是作用于腦干的中樞興奮藥，屬于一種γ-氨基丁酸受體拮抗劑，一次大劑量腹腔注射可引起較大強度的驚厥發(fā)作，但動物并不發(fā)展為癲癇，只有在長期反復(fù)閾下劑量刺激致多次癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）后才發(fā)展為癲癇（慢性點燃，kindling）[16]。因此，可以通過反復(fù)注射閾下劑量的PTZ建立與人類癲癇病相似的慢性癲癇模型。

近幾年的研究表明，NMDA受體參與體內(nèi)許多生理和病理過程，其過度激活引起的谷氨酸興奮性毒性是導(dǎo)致某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病因，比如癲癇、腦缺血以及創(chuàng)傷性腦損傷等[17-18]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，NMDA受體是由4個亞單位圍繞成的離子通道型受體，主要由基本亞單位NRl與調(diào)節(jié)型亞單位NR2組成[3]。NR2決定NMDA受體的特性，對受體的組裝、表達、轉(zhuǎn)運和突觸的靶位點都起重要作用，分為NR2A、NR2B、NR2C、NR2D四種，不同的亞單位在大腦中的分布以及在生理和病理情況下的作用是不同的[3-4]。在成年大鼠海馬中分布的調(diào)節(jié)亞單位主要是NR2A和NR2B[19]。CHEN等[10]的研究發(fā)現(xiàn)NR2A亞單位特異性地參與腦損傷導(dǎo)致的顳葉癲癇病，該結(jié)論在急性癲癇持續(xù)狀態(tài)動物模型中得到驗證。在慢性癲癇模型中尚未進行NR2A、NR2B亞基作用的探索。

在本研究中，我們通過連續(xù)28 d腹腔注射35 mg/kg PTZ構(gòu)建PTZ誘導(dǎo)慢性癲癇大鼠模型并給予不同的NMDA受體拮抗劑（非選擇性NMDA受體拮抗劑MK-801、選擇性NR2A亞基拮抗劑NVP及選擇性NR2B亞基拮抗劑Ifenprodil）來探究NMDA受體NR2A、NR2B亞基在慢性癲癇中的作用，發(fā)現(xiàn)PTZ可引起大鼠驚厥發(fā)作和海馬神經(jīng)元大量丟失；給予MK-801和NVP可以減輕大鼠驚厥發(fā)作強度，這種作用從用藥2周后開始顯現(xiàn)并持續(xù)存在，而給予Ifenprodil不能減輕驚厥發(fā)作；MK-801、NVP和Ifenprodil均能減少海馬神經(jīng)元丟失。這提示驚厥發(fā)作可能與NR2A亞基有關(guān)，而神經(jīng)元損傷可能與NR2A、NR2B亞基均有關(guān)。

我們的研究結(jié)果與CHEN等[10]的結(jié)果一致。在匹羅卡品癲癇模型中，他們發(fā)現(xiàn)NR2A亞單位與癲癇的生成相關(guān)，NR2A和NR2B亞單位都與癲癇誘導(dǎo)的細胞死亡相關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)NR2A和NR2B亞單位在癲癇病生成中所起不同作用的原因是NR2A和NR2B亞單位與不同的信號通路相關(guān)，即選擇性抑制NMDA受體的NR2A亞單位能降低BDNF mRNA的表達，選擇性抑制NMDA受體的NR2B亞單位能降低ERK1/2磷酸化。

本研究采用尼式染色評估神經(jīng)元損傷程度。尼氏染色方法是德國病理學家Nissl于1892年創(chuàng)立，其主要根據(jù)是神經(jīng)元胞體內(nèi)含有大量嗜堿性的尼氏小體。在神經(jīng)元受損時，尼氏體的數(shù)量可減少甚至消失，因此根據(jù)形狀大小和數(shù)量差異，可判別神經(jīng)損傷程度[20]。我們在400倍鏡下計數(shù)神經(jīng)元來比較各組海馬不同區(qū)域的神經(jīng)元丟失情況。與PTZ組比，MK-801、NVP和Ifenprodil均能減少海馬神經(jīng)元丟失，提示神經(jīng)元損傷可能與NR2A、NR2B亞基均有關(guān)。海馬分區(qū)比較：CA1區(qū)神經(jīng)元丟失多于CA3區(qū)、DG區(qū)，這可能是因為CA1區(qū)對缺血損傷最不耐受[21]。

蛋白檢測結(jié)果顯示：與Control組比，PTZ組、PTZ+MK-801組、PTZ+NVP組和PTZ+Ifenprodil組海馬NR2A、NR2B亞基水平均下降，該現(xiàn)象可能與神經(jīng)元受損壞死后膜蛋白溶解有關(guān)[10，22]。

綜上，臨床上大部分癲癇病例均表現(xiàn)為長期反復(fù)發(fā)作的慢性癲癇，因而探索慢性癲癇的發(fā)病機制尤為重要。目前，在離體細胞實驗和急性癲癇模型中均表明NR2A亞基介導(dǎo)了致驚厥作用，但NR2A亞基在慢性癲癇模型中的作用研究仍偏少。我們在慢性癲癇模型中探索NR2A、NR2B亞基與驚厥發(fā)作的關(guān)系，結(jié)果顯示驚厥發(fā)作可能與NR2A亞基有關(guān)，該亞基可能成為抑制癲癇發(fā)作的靶點之一。但本研究尚未對NR2A亞基介導(dǎo)抗驚厥發(fā)作的機制進行探索，需要更深入的研究來闡明NR2A亞基與受Ca2+調(diào)控的信號通路的關(guān)系。