李曉英 趙艷景 閻斌倫 董志國

（淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222005）

蛋白質(zhì)是生命體的基本組成物質(zhì)，也是生命活動(dòng)最終控制者和直接執(zhí)行者，它幾乎參與了所有生命活動(dòng)，人類對于蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)有一百多年的歷史。蛋白層析系統(tǒng)是當(dāng)前蛋白純化工作中常見的一種設(shè)備，自動(dòng)化程度較高，本文結(jié)合筆者多年使用該儀器的工作經(jīng)驗(yàn)，以美國伯樂公司的Biologic Duoflow蛋白層析系統(tǒng)為例，對蛋白層析系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、工作原理、常用的蛋白分離方法及使用與維護(hù)手段進(jìn)行詳細(xì)介紹，旨在提升初學(xué)者使用該系統(tǒng)的能力，加強(qiáng)我國蛋白質(zhì)分離技術(shù)。

1 Biologic Duoflow蛋白層析系統(tǒng)構(gòu)造及工作原理

蛋白純化系統(tǒng)由4部分構(gòu)成，即梯度泵、混合器、檢測器和組分收集器。Biologic Duoflow蛋白純化系統(tǒng)的工作原理如圖1所示。

圖1 蛋白純化系統(tǒng)工作原理

在蛋白純化系統(tǒng)中，梯度泵是整個(gè)系統(tǒng)的心臟，實(shí)驗(yàn)所用的所有試劑、樣品都是通過梯度泵進(jìn)入到整個(gè)管路中進(jìn)行分離的?；旌掀魍ǔＴ谶M(jìn)行離子交換層析時(shí)使用，它能將兩種緩沖液按不同百分比進(jìn)行配比。檢測器是蛋白純化系統(tǒng)的“眼睛”，它的檢測波長范圍為10～700nm，只要存在分離的蛋白質(zhì)便能檢測出來，然后在電腦記錄儀上以洗脫峰形式呈現(xiàn)出來，同時(shí)將相關(guān)信息傳導(dǎo)至組分收集器中。

2 幾種常見的蛋白分離方法

2.1 親和層析

親和層析是利用生物大分子與某些相對應(yīng)的專一分子特異識別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的層析方法。該蛋白分離方法選擇性強(qiáng)、純化效率高，常?？梢砸徊将@得滿意的純化效果。但由于親和層析法依賴的是生物學(xué)特異性而不是物理化學(xué)性質(zhì)，故只適用于分離低濃度的待純化蛋白質(zhì)。

2.2 凝膠過濾層析

俗稱分子篩，是利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的顆粒的分子篩作用，根據(jù)被分離樣品中各組分相對分子質(zhì)量大小的差異進(jìn)行洗脫分離的一項(xiàng)技術(shù)。利用凝膠過濾層析進(jìn)行蛋白分離，高分子量的蛋白質(zhì)在填料顆粒間隙中流動(dòng)，比低分子量早流出柱子，中等大小的蛋白質(zhì)可以進(jìn)入填料分子中較大的孔內(nèi)，而小蛋白質(zhì)可以進(jìn)入所有填料的孔內(nèi)，有最大的通過體積。

2.3 離子交換層析

該方法主要是利用不同蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)達(dá)到蛋白分離、純化蛋白質(zhì)的目的。分離柱的交換劑是由大量帶電荷的側(cè)鏈和不溶性樹脂結(jié)合而成。蛋白溶液進(jìn)入離子交換柱后，與離子交換樹脂無親和力的蛋白質(zhì)被洗脫，余下的蛋白質(zhì)均結(jié)合在樹脂上，但與樹脂的親和力又各不相同，此時(shí)可逐漸提升洗脫液中NaCl濃度，將其逐一洗脫出來，這樣就達(dá)到了分離蛋白質(zhì)的目的。

2.4 疏水作用層析

該方法以介質(zhì)疏水基團(tuán)和蛋白質(zhì)疏水區(qū)域間的親和作用為基礎(chǔ)，可溶性蛋白質(zhì)在外表面存在疏水小區(qū)，這些暴露的疏水區(qū)對疏水層析是非常理想的場所。溶液鹽濃度增加時(shí)疏水作用變得更強(qiáng)，所以大多數(shù)疏水層析都是高鹽時(shí)上樣，降低鹽濃度時(shí)洗脫。分離溫和且分離蛋白質(zhì)含量高，使疏水層析在蛋白質(zhì)純化中成為很有價(jià)值的一種技術(shù)方法。

3 Biologic Duoflow蛋白層析系統(tǒng)的保養(yǎng)與維護(hù)

為了確保系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行，每次的開機(jī)順序?yàn)椋合乳_硬件系統(tǒng)，即按照梯度泵、檢測器、混合器以及組分收集器順次依次打開電源開關(guān)，待硬件系統(tǒng)穩(wěn)定后，再打開電腦監(jiān)視器的軟件系統(tǒng)。

所有用于層析系統(tǒng)的水、緩沖液等試劑溶液，要和所有樣品一樣，在使用前通過0.45μm微孔濾膜過濾，并通過真空抽氣裝置或超聲波對以上各試劑溶液和樣品脫氣，確保溶液和樣品中無微顆?；蛉芙鈿怏w。

實(shí)驗(yàn)之前要用配套的注射器對梯度泵進(jìn)行真空抽氣，操作的順序?yàn)椋合葘⒆⑸淦鞑迦胩荻缺玫摹癙riming”接口，再旋松螺旋，抽出泵中的溶液，抽完之后先旋緊螺旋再拔注射器。重復(fù)上述操作數(shù)遍，直到抽出溶液不含氣泡為止。

每次實(shí)驗(yàn)之前都要將閥門轉(zhuǎn)到Purge位，沖洗梯度泵約2min左右，確保梯度泵內(nèi)沒有氣體為止。用過濾脫氣的超純水沖洗梯度泵及其管道，再用針筒各抽取10ml超純水打入泵上方的泵頭沖洗入口，進(jìn)行泵頭清洗。若設(shè)備長時(shí)間停用，還要進(jìn)行停用維護(hù)，操作順序?yàn)椋合葘μ荻缺眠M(jìn)行真空抽氣操作，然后用過濾脫氣的20%乙醇溶液沖洗整個(gè)系統(tǒng)、閥門及其管道，并定期檢查與維護(hù)。

4 應(yīng)用實(shí)例

抑癌活性蛋白是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，縊蟶抗癌活性蛋白組分Y3就是縊蟶經(jīng)緩沖液浸提后，利用Biologic Duoflow蛋白層析系統(tǒng)和DEAE纖維素離子交換層析，得到不同蛋白質(zhì)組分，收集具有抑癌活性較強(qiáng)的峰3，如圖2所示。

峰3經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠層析純化，收集具有抑癌活性更強(qiáng)的峰3，簡稱Y3，如圖3所示。

圖2 DEAE離子交換圖譜

圖3 Sepharose CL-6B凝膠層析圖譜